一、材料与方法

(一)材料及试剂

本研究所用的75份耳皮肤组织样本均采自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的WZSP近交系培育基地，其中F13世代15头，F14世代13头，F15世代11头，F16世代14头，F17世代14头，F18世代8头，全部样品用75％酒精处理后，于-20℃冰箱保存，备提DNA。

10×PCR Buffer、dNTP和TaKaRa Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程大连有限公司；ABI3130XL遗传分析仪上样缓冲液去离子甲酰胺(Hi-Di)和分子量内标GeneScan-500 LIZ购自ABI公司。

(二)方法

1.DNA的提取和检测  参考分子克隆实验指南，采用常规的酚抽提法，将提取到的DNA溶于TE中，-20℃保存。用琼脂糖凝胶电泳和DU640 Nucleic Acid and Protein Analyzer双重检测DNA的纯度和浓度(图1-35)，然后稀释到50ng/μL备用。

2.微卫星标记选择和引物设计

根据Barker(1994)的微卫星标记选择标准：应为公共所有；微卫星基因座间基本不连锁；符合孟德尔遗传规律；每个微卫星基因座至少有4个等位基因。综合考虑微卫星基因座在染色体上的位置、引物序列组成特点、多态性、产物大小等多方面因素，最后确定了不同染色体上的14个微卫星标记(表1-34)，并且采用6-Fam(蓝色)和Hex(绿色)两种荧光染料在其正向引物5'末端进行标记，然后用ABI 3130XL遗传分析仪进行片段大小的检测。

3. 14个微卫星基因座的PCR扩增  14对微卫星标记引物根据其扩增的片断大小和标记的荧光颜色分为5个组，每组中的片段大小和荧光颜色不发生重叠，同一颜色内的不同引物彼此扩增的片段大小相差1Obp以上。首先对每一个基因座进行最佳退火温度的梯度摸索，最后使用如下反应条件完成PCR扩增：95℃变性5min；94℃解链30s、52～60℃退火30s、72℃复性40s，40个循环；最后在72℃延伸10min。PCR反应的总体积为15μL：引物F 0.2μL，引物R 0.2μL，dNTP 0.3μL，Taq酶0.1/μL， Mg2+稀释液0.9μL，ddH2O 9.8μL，模板DNA 2μL，10×PCR Buffer 1.5μL。

4.微卫星基因座的扫描  将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带的强弱程度确定加入量，一般为0.3～1.0μL，上样缓冲液去离子甲酰胺(Hi-Di)7.75μL，分子量内标GeneScan-500 LIZ 0.25μL。具体步骤如下：①根据样本量计算出所需上样缓冲液去离子甲酰胺(Hi-Di)和分子量内标GeneScan-500 LIZ的总体积，用微量加样器量取后充分混合，根据每孔8μL的量分别添加到ABI测序仪专用96孔板的加样孔中；②根据已计算好的PCR产物的量，将PCR产物加到对应的孔中；③3000r/min离心瞬时，取出后95℃变性5min，立即冰浴5min；④上样于ABI 3130XL遗传分析仪，运行Data Collection程序，开始电泳、收集荧光信号、形成胶图。

5.数据统计分析  利用Gene Mapper软件对收集的原始数据进行分析，辅以人工校正，得到 WZSP近交系的微卫星基因座等位基因片段的大小和基因型；根据个体的基因型数据来估算总群体、各家系和各世代的基因杂合度(H)、多态信息含量(PIC)和等位基因数目(N)。

二、结果

(一)近交群体等位基因的组成

荧光PCR产物的检测结果如图1-36所示。各泳带表示WZSP微卫星基因座的等位基因大小和基因型，例如，第一条泳带表示S0070基因座在第51号个体的等位基因大小和基因型，其中有2个等位基因片段，大小分别为264bp和276bp，为杂合基因型。以次类推，第二、三、四、五条泳带分别表示 S0036、SW1377、SW2、SW2409基因座在60、68、60、51号个体的等位基因大小和基因型，其中51号个体在SW2409基因座上仅存在一个片段大小为93bp的等位基因，为纯合基因型。

在14个微卫星基因座上共检测到38个等位基凶，其中SW2409、SW510和SW71三个基因座在13世代时就已经完全被固定而仅表现纯合基因型。

 (二)近交系群体的基因杂合度

从表1-35中可以看出，75头WZSP近交系14个微卫星中共发现35个基因，其微卫星位点杂合度的变化由0～0.67，其中有3个位点杂合度为0，剩余的11个位点中有3个位点的杂合度在0.33～0.49，另外8个位点在0.54～0.67。其由三个家系组成的群体在14个微卫星位点上的平均杂合度为0.37。此外，14个位点的等位基因数最多为4，最小为1，平均为2.71个。结果表明：所培育的WZSP近交系群体平均多态信息含量也仅为0.37，远远低于目前海南原产五指山猪的4个家系的多态信息含量。

(三)近交群体F13～F18世代的基因杂合度和等位基因数

由表1-36和1-37可以看出，各个世代的杂合度和等位基因数均随着近交代数的推进而逐渐降低，这是近交系所特有的规律。至F18世代时尤为明显，其平均杂合度和等位基因数已由F13世代时的0.31和2.21分别下降到了F18世代时的0.20和1.64，F18世代中有8个基因座上的等位基因已经被固定，说明F18世代中有80％左右的个体的基因型已经纯合。但另外一些基因座则表现出明显的异常，例如 SW874和SW936，这些基因座上的杂合度随近交代数的增高而呈现不规律的波动。这些永不纯合的基因座可能与维持WZSP近交系的特异种质特性有关，我们且称之为WZSP近交系的“生命基因”，这一推论需要在今后利用基因敲除等方法进一步加以验证。

由表1-37可以看出：各个世代的杂合度随着近交代数的推进而降低，这是近交系所特有的规律。尤其在F18尤为明显，其平均杂合度已降至0.2，说明F18代中有80％的个体是纯合子。另外从14个微卫星位点的等位基因数目来看，F18中8个位点的等位基因数为1，这些位点是SW2409、SW1377、 SW0070、SW61、SW2、SW510、SW902和SW71；从表1-37中还可看出14个位点的平均等位基因数从F13的2.21明显下降到F18的1.64，但也有一些位点表现出异常，如SW936和SW874。这些位点在代数增加的过程中表现为不规律性，具体表现为杂合度没有明显下降趋势而是呈不规律性波动，其平均杂合度分别为0.52和0.60，均高于群体的平均杂合度0.42，表现为多态性。

(四)三家系间基因杂合度

由表1-38可以看出，WZSP近交系的三个家系的平均等位基因数和杂合度分别为2.36、2.29、2.50和0.41、0.45、0.42；从14个位点的等位基因数来看，表明三个家系之间已呈现分化的趋势，如 SW2位点和SW225位点其等位基因数分别为3、2、4和2、4、3，Ⅰ系中含有2个等位基因的位点有5个，分别是SW1377、SW61、SW225、SW902、SW1119，Ⅱ系中含有2个等位基因的位点有6个，分别是SW0070、SW61、SW2、SW0036、SW902、SW1119，Ⅲ系中含有2个等位基因的位点有4个，分别是SW0070、SW61、SW902、SW1119。因此，三个家系已经表现出向着本系相关基因纯化的方向进化；而与此相反，SW205。SW936却在三个家系中表现高度多态性，其等位基因数在三个家系中都为4和3，而且其杂合度分别为0.68、0.69、0.68和0.61、0.78、0.62表现为一直不纯合。

(五)WZSP近交家系Ⅰ F14～F16的微卫星检测

表1-39为WZSP近交家系Ⅰ三个世代的14个微卫星检测的结果，F14、F15、F16代的平均杂合度分别为0.44、0.36、0.38，揭示其近交程度随世代的增加而增加，而且其平均等位基因数也呈现相同的变化规律，F14、F15、F16的平均等位基因数分别为2.2、1.8、1.8。此外，14个微卫星位点中 SW2409、SW71、SW510在三个世代都呈现完全纯合的状态，其杂合度为0。而SW225、SW0070在 F16的杂合度为0，也从另一方面证明了WZSP的近交程度有可能随着代数增加变得更大，基因纯合的位点还会增加。但是，其中有些位点也成相反的变化规律，如SW61、SW2，它们在三个世代的杂合度分别为0.33、0.5、0.75和0.16、0.5、0.75，但是它们的多态信息含量和等位基因数却变化不大，分别为0.34、0.37、0.37和0.36、0.37、0.34；等位基因数都为2，说明这些基因的杂合有可能是 WZSP近交系生存所必需的或者是与本家系的特有属性有关。详细结果如下表1-39所示。

(六)WZSP近交家系ⅡF15～F18的14个微卫星位点的检测

表1-40为WZSP近交系ⅡF15～F18的14个微卫星位点的检测结果，14个被检位点中有7个位点达到完全纯和，它们分别是SW2、SW1377、SW0070、SW61、SW2409、SW71、SW510，其中后三者在4个世代中的杂合度都为0，不仅如此，每个世代的平均杂合度也呈明显的递减趋势，F15～F18的平均杂合度分别为0.37、0.36、0.32、0.25；平均等位基因数分别为：2.3、1.7、1.85、1.78，其系平均杂合度为0.32，低于群体平均杂合度0.42，由此说明，该家系的近交程度较高。SW1119、SW0036、 SW874、SW205、SW902这些位点的平均杂合度分别为0.47、0.53、0.50、0.74、0.62，均明显高于该系和群体的平均杂合度0.32、0.42。这些位点的杂合度变化也呈现无规律性，但是它们共同的特点就是在每个世代中总保持较高的杂合度，表明这些等位基因的杂合状态可能是WZSP近交系生存所必需的或者是与本家系具有的某一特性有关，也有待进一步研究来证实。详细结果见表1-40。

(七)WZSP近交家系Ⅲ系F14～F17的14个微卫星位点的检测

表1-41为WZSP近交家系Ⅲ系F14～F17的14个微卫星位点的检测结果，从F14～F17家系Ⅱ的近交程度逐渐减弱，4个世代平均杂合度分别为0.42、0.46、0.39、0.48，本系平均杂合度仅为0.44，高于群体杂合度0.42，但是其平均多态信息含量仅为0.3，在0.25和0.5之间属于中等多态信息。从微卫星位点的纯化程度来看，只有SW2409、SW510、SW71三个的杂合度为0，除SW0036、SW225外，其余9个位点的杂合度均高于群体杂合度，即使如此，也低于版纳小耳猪近交系的群体平均杂合度。结果表明：从F14～F17家系Ⅲ的近交程度逐渐减弱或是由于基因突变引起的或是其他原因造成的有待进一步研究证实。其详细结果如表1-41。

(八)WZSP近交系三个家系间等位基因的比较研究

由表1-42可以看出，三个家系已经有了明显的分化，其分化系数为0.07，但是各系的近交程度有所不同。其中Ⅱ系程度最高为0.32，其次是Ⅰ系0.4，最后为Ⅲ系其杂合度为0.44，平均多态信息含量、平均等位基因数分别为0.26、0.25、0.32和2、1.92、2.17，均与杂合度表现一致。因此，从分子遗传学的角度来讲，WZSP近交系的三个家系已经各自成系。

三、讨论

(一)我国小型猪品种及其近交系(群体)的遗传多样性

我国有4个著名的小型猪地方品种，即海南五指山猪、滇南小耳猪、贵州小型香猪和巴马香猪。王昕等利用10个微卫星基因座首次对这4个品种的原种群进行了遗传学检测，各群体的样本数量分别为60、59、60、46，杂合度分别为0.716 5、0.6611、0.6602、0.5990，多态信息含量分别为0.6871、0.6069、0.5995、0.5774，等位基因数分别为3.8811、3.1265、3.1555、3.5099；其中仅有1个基因座(S0003)在4个品种中均表现单态；作者指出这些小型猪品种的遗传变异要低于其他地方猪品种，这可能与小型猪的长期闭锁繁育有关。张桂香等采用26个微卫星基因座对原产自贵州省贵阳市的香猪、云南省西双版纳州的滇南小耳猪和海南省琼山市的五指山猪的遗传多样性作了进一步分析，每个群体的样本数量均为60头，它们的杂合度分别为0.78、0.82、0.86，多态信息含量分别为0.76、0.80、0.84，等位基因数分别为13.15、13.88、15.73，而平均等位基因数分别为6.50、7.10、8.89。杨述林等报道的贵州香猪(60头)以及云南滇南小耳猪(60头)在这26个微卫星基因座上的观察及期望杂合度和等位基因数分别为0.628、0.784、12.54和0.574、0.820、13.46。申学林等和姚绍宽等又对原产于贵州省剑河县的剑白香猪和久仰香猪、贵州省从江县的从江香猪和广西环江县的环江香猪等4个香猪地方类群的23个微卫星基因座的遗传变异进行了测定，每个群体的样本数量均为50头，通过与张桂香等的相应数据进行整合和比较分析，发现所有23个基因座均表现多态，这4个香猪类群的杂合度、多态信息含量和等位基因数分别介于0.67～0.70、0.61～0.64、4.69～4.86，均显著低于张桂香等和杨述林等所测定的相应品种。这主要归因于这4个香猪类群基本均处于相对封闭的半放牧式繁育状态，其中存在一定程度的近交；而张桂香等所分析的3个小型猪品种的样品均采自群体规模较大的保种场，而且在保种过程采取了避免近交的措施；其中的五指山猪保种群则是从海南各地收集种猪组建的。方美英等利用34个微卫星基因座对云南滇南小耳猪(30头)、贵州香猪(30头)及海南五指山猪(30头)开展了研究，发现这三个品种的杂合度和平均等位基因数分别为0.66和2.94、0.67和3.03、0.75和4.00。Kim等发现中国香猪(28个个体)以及五指山猪(22个个体)在16个微卫星基因座(其中的14个被用于本研究)上的观察及期望杂合度和等位基因数分别为0.599、0.619、4.69和0.5151、0.502、3.44。王希龙等通过利用32个微卫星DNA标记对海南省五指山猪国家级原种场的保种核心群进行了评价，结果表明全部32个基因座表现多态，其杂合度、多态信息含量和等位基因数分别为0.558、0.708和9.41。侯冠或等应用26个微卫星基因座对中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所保种场的五指山小群体进行了检测，其样本数量为58份，全部基因座均表现多态，观察及期望杂合度、多态信息含量和等位基因数分别为0.338及0.835、0.807和11.92。

张桂香等指出我国56个地方猪品种的杂合度和多态信息含量分别介于0.44～0.87和0.39～0.86，而方美英等报道的我国32地方品种的杂合度介于0.41～0.79，平均等位基因数介于1.7～4.8。可以看出这4个小型猪品种的原种群或保种核心群的遗传多样性因其样本来源而异，接近或甚至略高于我国地方猪品种的平均水平。

商海涛等利用35个微卫星基因座对经10余年封闭或近交培育而建立的贵州小型香猪、广西巴马小型猪和版纳小耳猪的近交群体作了测定，其中版纳小耳猪近交系已培育至14世代，分化为体形大小不同的JB和JS两个亚系；4个群体的样本数量为分别为12、12、10、26头，其中JB和JS的样本来源于10～14世代的混合个体；其杂合度分别为0.4027、0.3454、0.3282、0.3792，多态信息含量分别为0.4253、0.3520、0.3456、0.3972；值得注意的是其中仅有1个基因座被固定在这些群体中。牛荣等在对相同来源的版纳小耳猪两个亚系中5个近交家系、10～14世代的32个体采用上述35个微卫星基因座进行分析时发现，其中有7个基因座在这5个家系中均表现单态，总群体的平均杂合度为0.5028，各家系的杂合度及多态信息含量分别介于0.2315、0.1827(4份样本)和0.4452、0.3802(10份样本)之间。牛荣在另一报道中涉及了与商海涛等相同数量的微卫星基因座和相同样本来源，虽然贵州小型香猪和广西巴马小型猪的样本数量均升至14头，但其平均杂合度和多态信息含量与前一研究完全相同，而其等位基因数及平均等位基因数分别为2.1714和1.9429及1.8026和1.6845。牛荣等进一步分析了上述4个群体的12个微卫星基因座的结果，指出这些小型猪的遗传多样性较低，仅有1个基因座在这些群体中表现单态，其他个别基因座上可能存在小型猪特有的等位基因。牛荣等在仅利用21个微卫星基因座对相同来源的12头广西巴马小型猪进行分析后发现，其杂合度为0.3881，略高于在35个微卫星基因座上的结果，而多态信息含量则微降至0.3501；其中有3个基因座的等位基因在这一群体中被固定下来。另外，牛荣等在利用12个微卫星基因座对相同来源的版纳小耳猪近交系进行分析时发现，其中也仅有1个基因座的等位基因已被固定，而S0062基因座上的多态性等位基因在JS亚系中的片段较大(190～242bp)，在JB亚系则较小(147～190bp)，表明亚系之间在这一基因座上出现了分化。叶香尘采用21个微卫星基因座对广西大学培育的广西巴马小型猪近交群体3～7世代的41个个体的基因型进行了测定，发现其中有4个基因座表现单态，总群体的观察及期望杂合度、多态信息含量、等位基因数和平均等位基因数分别为0.2904及0.3434、0.3048、2.381和1.7683，而且这些参数随近交代数的递增而逐渐降低。王希龙等和黄礼光等对海南省五指山猪国家级原种场近交选育至第三世代的、5个重要家系内的150余头海南五指山猪进行了测定，所采用的32个微卫星基因座全部表现多态，总群体的杂合度、多态信息含量和等位基因数分别为0.559、0.731和13.66；王希龙等进一步采用30个微卫星基因座对与上一研究有相同来源和世代的4个群体的114头五指山猪作了分析，发现几乎所有基因座在4个群体中均表现多态(仅有1个基因座在其中1个群体中呈单态)，群体中的杂合度、多态信息含量及等位基因数分别介于0.520、0.507及4.533(12份样本)和0.549、0.691及8.300(54份样本)之间。这些参数与该品种的保种核心群基本一致，也就是说，初期的低度近交对这些群体的遗传多样性几乎没有影响。张青峰等曾采用9个微卫星基因座对本研究所涉及的WZSP三个近交家系之14～16世代共50个体的遗传变异进行了初步分析，其中有2个基因座固定，总群体的杂合度、多态信息含量和等位基因数分别为0.3849、0.3270和2.11。

综上所述，我们不难看出，在实验动物化的过程中，基于4个小型猪品种所建立的近交群体或品系的遗传多样性均显著低于原种群或核心群，初步达到了通过近交来提高这些实验群体内遗传同质性的目标；另外，这些近交群体已经与原种群或核心群表现出较高水平的遗传分化，开始形成并拥有各自的特征。

本研究进一步采用了14个微卫星基因座对WZSP三个近交家系之13～18世代的75个个体的遗传多样性水平和变化规律开展了系统的分析，发现在13世代时就已经有3个基因座被固定下来了，而到18世代时被固定下来的基因座高达57％(8/14)，这是所有这些近交群体或品系中最高的比例。本研究总群体的杂合度为0.42，极显著地低于在海南省原地保种、建群的三世代五指山猪近交群体和近交到10～14世代的版纳小耳猪近交家系总群体的杂合程度；而18世代的杂合度已经降低至0.20，即大约80％的个体已经拥有趋于纯合的基因组，这也显著地高于近交至7世代时的广西巴马小型猪近交群体(0.2768)、近交到10～14世代时的版纳小耳猪最好水平的一个近交家系(仅有4份样本的805家系为0.2315)和未知培育程度的贵州小型香猪(0.4027)和广西巴马小型猪(0.3454)的近交群体。本研究总群体的多态信息含量为0.37，与未知培育程度的贵州小型香猪和广西巴马小型猪近交群体接近，极显著地低于3世代时的五指山猪近交群体，但却显著地高于仅有4份样本的版纳小耳猪的805家系(0.1827)和近交至3世代时的广西巴马小型猪近交群体(0.2778)。应该指出的是，杂合度和多态信息含量两参数的变化范围为0～1，对基因座上等位基因数目的增加或减少甚不敏感，而微卫星遗传标记的最重要特征之一就是其丰富的多态性，当然等位基因数的变化与样本数量又有直接关系。本研究总群体的等位基因数为2.71个，到18世代时已降至1.64，这极显著地低于3世代时的五指山猪近交群体，也均低于近交至7世代时的广西巴马小型猪近交群体(1.9048)和未知培育程度的贵州小型香猪(2.1714)和广西巴马小型猪(1.9429)的近交群体。

因此，我们可以完全肯定地讲，繁育至18世代的WZSP近交家系的遗传同质性已经达到了相当高的水平。

(二)五指山猪近交系群体分析

微卫星DNA是由2～5个核苷酸重复序列所构成的核心部分及侧翼序列构成，侧翼序列的特异性，使微卫星DNA特异地定位于基因组的特定位点，核心序列重复次数的差异形成微卫星DNA在同一位点上的多个等位基因。本研究所用的WZSP近交系是中国农业科学院畜牧所于1988年引自海南中南部、经近交培育而成的。试验中所用的样本，均来自畜牧所的五指山猪保种场的F13～F18代的三个家系的猪。试验表明在由F13～F18 6个世代组成的群体中，具有多态性14个微卫星位点的平均杂合度为0.42，也就是说整个群体约58％的个体趋于纯合。国外小型猪近交系数一般在30％～60％，最高也不超过75％，Van Zeveren等用7个微卫星座位研究4个比利时猪种的平均杂合度在0.54～0.67；Dimoski等用18个微卫星座位测得约克夏、大白猪英系约克夏的平均杂合度分别为0.53和0.6；樊斌等用27个微卫星座位测得湖北省3个主要地方猪种通城猪、清平猪和阳新猪的平均杂合度分别为0.748、0.698、0.627。由此看出，WZSP近交系处于近交程度较高的状态。

同样，等位基因数也可以作为衡量一个品种近交程度的指标。本试验结果表明，14个微卫星的平均等位基因数为2.7。而2006年叶向尘等在对广西巴马小型猪近交系的研究中发现，巴马小型猪的平均杂合度为0.3，平均等位基因数为2.38，各数值均低于本试验。分析其原因有可能是由所选位点的差异所致。因为叶香尘等人所用的21个位点仅有1个位点存在于本试验的14个位点之中，但是通过比较可以发现，这两种不同品种猪近交系的杂合度和等位基因数都很低，这是近交系的最主要特征。而且在本试验中还发现，WZSP近交系的SW71、SW510和SW2409这三个位点在群体中表现绝对纯合，即等位基因数为1，纯合率维持100％。张桂香等采用27个微卫星标对56个中国地方猪品种和3个引进猪种杜洛克猪、长白猪、大白猪进行遗传多样性分析，结果显示，59个猪品种在26个微卫星座位上拥有的有效等位基因数范围为2.12～9.03，观测等位基因数3.88～15.73。由此可以看出，WZSP近交系已成为遗传纯度很高的近交群体。

多态信息含量(PIC)是衡量片段多态性的较好指标，根据Bostein等的报道，当多态信息含量＞0.5，该基因座为高度多态性基因座；当0.25＜多态信息含量＜0.5时，为中度多态性基因座。当多态信息含量＜0.25时，为低度多态性基因座。樊斌等用27个微卫星对湖北通城猪、清平猪和阳新猪3个地方猪种进行分析，结果显示平均多态信息含量为0.6～0.74。李雪梅等对中国10个猪品种微卫星分析表明，7个地方品种的平均多态信息含量为0.46～0.67，2个国外引入品种为0.74和0.56。吴迪等人对甘肃合作猪和迪庆猪进行微卫星测定得出它们的多态信息含量分别是0.74和0.56。王系龙等测得海南五指山猪全群、核心群、近交群的平均多态信息含量分别为0.74、0.7和0.73，均高于本试验测得的0.37，说明经过长期的近交培育五指山猪的某些基因已经丢失，从而使群体呈现中等多态性。

(三)WZSP近交系的家系分化

从WZSP三个近交家系的杂合度和等位基因数以及等位基因构成上的差异来看，它们已经逐渐向着特有的方向分化。例如家系Ⅰ的杂合度为0.41，其中杂合度最小的基因座为S0070(0.37)，最大的基因座为SW205(0.68)；家系Ⅱ的杂合度为0.45，其中杂合度最小为基因座为SW2(0.19)，最大的基因座为SW936(0.79)；家系Ⅲ的杂合度为0.42，其中杂合度最小的基因座仍为SW2(0.27)，最大的基因座则为SW205(0.69)。另外，各基因座上的等位基因数在三个家系之间也表现一定的差异。这一现象也存在于近交到10～14世代的版纳小耳猪两个亚系的5个近交家系和近交至3世代的五指山猪的4个群体，这应该解释为在近交过程中各家系或群体中仅使用了极少数基因型不同的种猪，从而导致了显著的遗传漂变。

(四)WZSP近交系三个家系间的遗传分析

由表1-36可以看出，WZSP近交系的三个家系在基因上已经逐渐向着特有的方向分化。家系Ⅰ在14个等位基因上的平均杂合度为0.41，除三个位点达纯合以外，杂合度最小的位点为S0070，杂合度达到0.37，最大的为S874、S936，他们的杂合度为0.6，而其他两个家系的平均杂合度为0.45、0.42。因此，这三个家系的纯合程度都较高而且相近，与杂合度相一致；对等位基因数的研究结果表明，在三个家系中等位基因数为2个的位点有所不同，其中家系Ⅰ中有SW1377、SW61、SW205、SW902和 SW1119，家系Ⅱ中有SW0070、SW61、SW2、SW0036、SW902和SW1119，家系Ⅲ中有SW0070、 SW61、SW902和SW1119，这些位点的等位基因数都为2，而且不全相同，说明三个家系已经有了自己的分化方向，但是SW1119在三个家系中都存在，且杂合度都很高，分别为0.53、0.55、0.57。而 KIM等在2005年用16个微卫星位点对韩国、中国、欧洲部分猪种进行了多态性分析，其中我国猪种包括民猪、五指山猪、香猪，对五指山猪分析的结果表明，五指山的平均杂合度为0.5，平均等位基因数为3.44，均高于本试验中三个家系中的平均杂合度和等位基因数，由于其选用的16个微卫星位点中的12个位点恰与本试验所选的位点一致，因此，更加证明了实验用WZSP近交系与普通五指山猪在分子遗传学方面存有差异。另外，在KIM研究中，其他来源猪的平均杂合度的范围是0.49～0.70，平均等位基因数是3.44～5.81，都高于本试验的结果。并证实SW936基因位点含有其特有的等位基因。实验用WZSP近交系的各种生理生化指标均接近于人，与其他猪有着明显不同，这种表型上的特异性可能与某些特有基因的多态性有关。实验表明：在三个家系中SW205、SW936、SW874的等位基因数分别为4、4、4；3、3、3和4、3、4，而杂合度分别为0.68、0.69、0.68；0.61、0.78、0.62和0.6、0.58、0.57。如同牛荣等和叶香尘的观察，WZSP各近交家系的杂合度也随着代数增高而逐渐减小，但其中有相当一部分基因座仍表现较高水平的杂合度，它们并不会随世代的增高而呈现下降的趋势，而是在0.2～0.8左右波动，甚至到18世代时仍还有近43％(6/14)的基因座表现出较高水平的多态性，它们仍拥有2～4个等位基因，杂合度介于0.38(SW225)～0.60(SW936)。我们认为这些一直处于高度杂合状态的基因座应该被视为WZSP近交系的种质特异性，而与这些基因座处于同一连锁群的某些功能基因在维持极高近交水平下WZSP的基本生存能力中可能起着关键作用，即所谓的“生命基因”，其杂合状态是其一生所必需的。

表1-36、表1-38反映了五指山猪近交系在随着世代增加的过程中，14个微卫星位点的变化规律，由表1-37可以看出，F13的平均杂合度为0.31，F18的平均杂合度为0.2，虽然在F14～F17代呈现了波动，但是从总体来看，WZSP近交系的平均杂合度随着代数增加而减小。

尽管如此，从表1-37中也可以看出一些位点的杂合度并不会随着世代的增加而呈现下降的趋势，而是一直保持高度杂合状态，尤其在F18代表现更明显，如：SW0036、SW874、SW205、SW936在F18代的杂合度分别为0.46、0.59、0.41、0.6，均高于F18的平均杂合度0.2，而且在其他世代中变化不大。这可能与近交系WZSP的生命活动有关，对其具体的生理作用还需我们进一步研究。

(五)WISP实验用近交系工系的遗传分析

由表1-39可以看出，实验用近交系五指山猪Ⅰ系三个世代的平均杂合度为0.4，其平均等位基因数为2，并且在经过三代的近交培育之后，在14个被检位点中有3个位点的等位基因数由3变到2，有1个由2变到1，有3个位点一直处于1；但是有4个位点的等位基因数并未发生变化，维持在2和3，对于这些位点的杂合度来讲，大部分都随着等位基因数的减少而降低，但是有些位点却成相反的趋势，如：SW874其等位基因数由2变到3，但是杂合度并没有降低的趋势，总是维持在0.5的相对较高水平，SW205、SW1377、SW936、SW902，都显示出了异常的表现，它们三代的杂合度最低值都为0.5。此外，根据Bostein等的报道，当多态信息含量＞0.5，该基因座为高度多态性基因座；当0.25＞多态信息含量＞0.5时，为中度多态性基因座；当多态信息含量＜0.25时，为低度多态性基因座。而在本试验中除SW1377、SW902之外，大多位点的多态信息含量都小于0.5、大于0.25属于中等多态含量。李雪梅等对中国10个猪品种微卫星分析表明，7个地方品种的平均多态信息含量为0.46～0.67，2个国外引入品种为0.74和0.56。由此说明WZSP实验用近交Ⅰ系的多态信息含量、杂合度、等位基因数都明显低于正常猪种，带有明显的近交特征，而且存在几个特殊的位点如SW1377和SW902，这可能与该系的特异性有关，可在今后通过基因敲除或沉默的手段进行深入的研究。

(六)实验用近交系五指山猪Ⅱ系的遗传分析

表1-40反映了五指山Ⅱ系的一些遗传特征，该系的杂合度、平均等位基因数、多态信息含量分别为0.32、1.9、0.25，在三个家系中最低，其近交程度也最高，并且在被检的14个位点中有7个位点达到了纯合，即等位基因数为1，这与李瑞生等(2006)对近交系小鼠的研究中所发现的结果相似，他们发现F5的近交小鼠其纯合率为66.7％，在其检测的位点中有50％的位点为纯合位点，并且与本试验所发现的规律相似，随着代数增加，杂合度、等位基因数降低。由于小鼠本身的特性，他们采用的近交方法为全同胞，所以近交推进速度较快，仅10代就达到了纯合率为96.7％，所检位点的等位基因数为0。但是，五指山猪也有其本身的特性，即表型多样，在其不断的近交纯合过程中，不但要纯合有利的基因，还要保持该种的多样性。本试验就发现了一些这样的基因，如SW874、SW902、SW936，这些位点在4个世代的杂合度都随着世代的增加而增高，并且等位基因数的变化也呈现无规律变化，但是，除SW902外，它们的多态信息含量却很稳定，保持在0.3～0.36，属于中等多态信息含量。因为多态信息含量的高低可以反映出一个物种表型的多样性，WZSPⅡ系的平均多态为0.25，并且在4个世代呈明显下降趋势(0.3、0.25、0.26、0.18)，但SW874、SW936的多态信息含量只是在一定的范围内浮动，说明这些基因可能在维持Ⅱ系的某些特性，关于这些基因和该系的表型的关系，还需在今后进行深入研究。

(七)WZSP实验用近交系Ⅲ系的遗传分析

表1-41反映了WZSPⅢ系在14个微卫星位点的变化规律，该系五指山猪的平均杂合度与其他两系呈现相反的变化趋势，其在F14～F17的平均杂合度，分别为0.42、0.47、0.39、0.48，呈现波动式的上升，其平均等位基因数也在增加；然而，与前两参数相反，其多态信息含量总是维持在0.32，说明并未有新的等位基因产生，其杂合度与现海南产五指山猪的杂合度类似，Kim等人(2005)用了16个微卫星(其中有12个与本试验的位点一致)对22头海南产五指山猪进行检测，其平均杂合度为0.49，平均等位基因数为3.44。而欧江涛等(2005)对海南五指山猪的核心群进行了分子遗传学的检测，结果发现其平均杂合度仅为0.56，平均等位基因数为9.4。虽然该实验选用的32个微卫星中仅有一个与本实验相同，即SW71，但是其差异是显著的，在其检测的49头个体中，SW71的平均等位基因数为12，平均杂合度为0.53，多态信息含量为0.59；而本实验中，SW71在三个家系的所有世代中已达到完全纯合，既平均等位基因数为1，平均杂合度为0，多态信息含量为0。由此看出，实验用近交五指山猪三个家系的近交程度均高于海南五指山猪。造成Ⅲ系的近交程度低于其他两系的原因有可能是本试验选用的微卫星的数量有限，未能全面反应该系的近交变化规律，对于该系的遗传学分析有可能还需要用其他的微卫星位点来进行检测。

四、结论

本研究不仅再一次研究证实，利用2头经20年近亲繁殖、培育的具有资源创新的实验用五指山猪确为近交系，并首次初步揭示了WZSP近交系多态性微卫星位点上等位基因的变化规律，即分子遗传基础特征。即：随近交代数的推进，每个星座上等位基因数越来越少，基因的纯合度越来越高；部分基因座较早纯合，如SW2409、SW510、SW71在近交系F13时三个家系已经达到完全纯合；多数基因座随近交代数推进逐部纯合，少数基因永不纯合；近交过程中分离为不同的家系，其近交程度不仅完全一致，基因的纯合度亦有不同，WZSPⅡ系最高，其次为Ⅰ系和Ⅲ系；最重要的发现是，有少数几个基因座，如SW874和SW936等一直处于出乎预料的高度杂合状态，其基因纯合度不随着近交世代的增进而提高，这可能与WZSP近交家系的种质特异性有关，推测与这些基因座处于同一连锁群的某些功能基因在维持极高近交水平下WZSP的基本生存能力中起着关键作用，我们称之为“生命基因”。其杂合状态是其一生所必需的，有待深入研究验证。