摘要：SIRT6属于三类sirtuin家族，具有依赖于NAD+的组蛋白脱乙酰基酶活性，控制衰老、代谢和炎症等多个过程。近年来，越来越多的研究表明，SIRT6在肝癌发生发展中具有抑癌作用。我们在肝脏特异性SIRT6 HKO小鼠模型中建立了CCl4和DEN诱导的肝癌发生模型，发现肝脏SIRT6缺陷通过抑制ERK1/2途径显著促进肝损伤和肝癌的发生。SIRT6在小鼠肿瘤组织和人类HCC细胞中具有代偿性上调，而过表达的SIRT6在体外和体内均抑制肿瘤生长。综上所述，我们提供了一个有用的小鼠模型来描绘与慢性肝病和原发性肝癌有关的分子途径，并提示SIRT6可能是肝癌治疗的一个有希望的靶点。

关键词：ERK1/2通路  HCC  肝癌癌变机理   小鼠模型  SIRT6

简介：慢性肝病和肝细胞癌（HCC）正日益成为全球性的人类问题。 肝细胞癌作为原发性肝癌中最致命和最普遍的一种形式，它不是一种偶发事件，而是慢性肝病的缓慢进展，仍然是最致命的癌症类型之一。全世界每年有超过80万人被诊断为肝癌，缺乏成功的治疗方案。全世界男性肝癌的发病率和死亡率几乎是女性的三倍。虽然HCC是一种多因素疾病，包括遗传因素、环境因素、生活方式和饮食因素，但绝大多数病例通常是由肝硬化进展而来。考虑到肝癌死亡风险的增加和临床治疗选择的限制，迫切需要了解肝癌的促癌机制。在过去的几十年里，已经建立了大量的小鼠模型来研究肝癌的发病机制。二乙基亚硝胺（DEN）是一种著名的肝脏化学致癌物，通过产生活性氧和形成致突变的DNA加合物，可以引发与人肝癌相似的肝癌。C57BL / 6基因背景小鼠在第14天腹膜内注射25 mg / kg单剂量DEN， 9个月后在肝脏中形成肿瘤结节。 肝癌通常与慢性肝病继发的肝硬化有关。Domenicali等人将小鼠连续暴露于四氯化碳（CCl4）约12周后建立小鼠晚期肝硬化模型。作为促进因素，每周服用四氯化碳，加上饮酒，104周后发生肝癌。单一DEN联合腹腔注射CCl4的联合小鼠模型显示5月龄时肝脏肿瘤的发生率为100%。一些分子途径和细胞事件已被证明与肝癌的进展有关。SIRT6是sirtuin（SIRT）家族中NAD+依赖性蛋白脱乙酰基酶的一员，已被确认为人类基本过程（包括寿命、新陈代谢和炎症）的关键调节因子，全球SIRT6基因敲除小鼠在数周内死亡。衰老过程中的许多分子途径也有助于抑制肿瘤，越来越多的证据表明SIRT6在人类癌症中具有抑制肿瘤的作用。SIRT6在慢性肝病中起着重要作用，因为肝脏特异性SIRT6的丢失加速了脂肪肝和肝脏脂肪变性。然而，SIRT6在DEN和CCl4诱导的肝肿瘤发生中的作用和机制尚不清楚。鉴于SIRT6在肝功能中的关键作用，我们在肝脏特异性SIRT6缺失小鼠中建立了DEN和CCl4诱导的肝癌小鼠模型。通过激活ERK1/2途径研究了SIRT6缺陷对小鼠肝损伤和化学诱导肝癌发生的影响。

SIRT6基因敲除有助于化学诱导的肝癌发生：全球SIRT6缺陷小鼠在出生后第24天死亡。因此，为了了解SIRT6缺陷对肝脏肿瘤发生的影响，我们使用alb-cre转基因小鼠特异性地敲除肝脏中的SIRT6，该转基因小鼠主要在肝细胞中介导cre/loxp重组。二乙基亚硝胺（DEN）是一种被广泛接受的诱导肝癌发生的模型遗传毒性剂，在45-104周后，男性和女性的发生率分别为100%和30%，连续四氯化碳（CCl4）可促进肝纤维化的进展。为了研究SIRT6敲除是否会影响DEN和CCl4诱导的肝癌发展，向14日龄的雌性和雄性小鼠注射了单剂量25 mg / kg DEN作为引发剂，并重复注射了CCl4（溶于玉米油）作为促进剂长达14周。在7月龄终点时，肉眼可见的肿瘤发展，在雌性和雄性SIRT6敲除小鼠中均发现较多的HCC结节，，而WT雌性组8只小鼠中只有1只出现一个肿瘤结节。化学诱导的肝脏发育不影响其体重，定量分析显示，与野生型相比，SIRT6敲除使雌性HKO小鼠的肝脏体重比增加了16％，雄性HKO小鼠的肝脏体重比增加了11％。

图1、肝脏特异性敲除SIRT6促进DEN和CCl4诱发的小鼠肝癌。（A） 化学诱导肝癌小鼠模型的实验设计。在出生后14天给予25mg/kg的DEN，然后从8周龄开始每周两次注射CCl4，连续14周，28周时处死小鼠。（B）代表性的蛋白质印迹图像显示了HKO小鼠肝脏/肝脏肿瘤中SIRT6的敲除。（C）7月龄未经处理的正常WT和HKO小鼠的H＆E和Masson三色染色的肝脏切片。HKO小鼠在未诱导的情况下表现出更多的脂肪变性和纤维化。（D）H＆E染色肝脏切片的代表性显微镜图像。组织病理学检查显示，HKO小鼠更容易出现气球状，脂肪性肝炎和炎症浸润。 比例尺：500μm。（E）HKO小鼠表现出更严重的肝纤维化。（F–I）小鼠血清ALT、AST、TC和TG水平。（J）处死时四组动物的肝脏大体形态。 即使雌性小鼠不易于形成肿瘤，SIRT6基因敲除在雌性和雄性组中均显示出更多的HCC结节。蓝色箭头表示雌性小鼠的肿瘤结节。（K） 4组小鼠7月龄时肿瘤结节（J）、总体重（BW）、肝脏重量（LW）及LW与BW的比值。

为了阐明SIRT6丢失对DEN和CCl4诱导的肝损伤恢复的影响，我们对肝脏切片进行了H&E和Masson三色染色，发现雌雄HKO小鼠比WT小鼠更容易出现气球样、脂肪性肝炎和炎症浸润，，雄性小鼠肝损伤的发生率更高。使用METAVIR肝纤维化评分来衡量纤维化/肝硬化的范围，从0（无纤维化）到4（肝硬化）。定量分析显示纤维化评分严重。 DEN和CCl4暴露后，HKO小鼠血清肝损伤的标志物ALT，AST，TC和TG显著增加。综上所述，首次研究了SIRT6缺陷导致DEN和CCl4诱导的小鼠肝癌发生。

SIRT6在肿瘤组织中上调并且限制了HCC细胞增殖和肿瘤生长：据报道，小鼠肝脏特异性SIRT6缺失在大约7.5–13个月发展出90％的脂肪肝。H＆E和Masson的三色染色发现HKO小鼠7月龄在没有化学治疗的情况下比正常对照组表现出更严重的脂肪变性。鉴于发现SIRT6是一种肿瘤抑制因子，而SIRT6的缺乏会导致肝损伤和癌症，我们检查了SIRT6在肿瘤组织中的表达，并发现与非肿瘤相比，即使在HKO小鼠肿瘤中，SIRT6的表达也上调。Western blotting分析显示，与正常人肝细胞相比，人HCC细胞系中的SIRT6也上调。SIRT6在肿瘤中可能是代偿性增加，以抑制癌症的发展。为了评估SIRT6在体外细胞增殖中的作用，我们成功地通过shRNA敲除了人HCC细胞株HuH7中的SIRT6，并通过pcDNA3.1-SIRT6转染来过表达SIRT6。细胞克隆形成实验表明，过表达的SIRT6抑制HuH7细胞中的细胞克隆形成，而敲除SIRT6则显著提高了克隆形成能力。总而言之，这些数据表明SIRT6在肿瘤中代偿性过度表达，并在限制体外细胞克隆形成中发挥作用。

图2. SIRT6在肿瘤组织中上调，促进HCC细胞增殖和肿瘤生长抑制。（A）代表性的蛋白质印迹图像显示SIRT6在人HCC细胞系和正常人肝细胞系中的表达。. （B–C）RT-qPCR和western blotting法检测shRNA对HuH7细胞SIRT6的敲除作用。（D-E）RT-qPCR和蛋白质印迹分析证实了SIRT6的过表达作用。（F）过度表达的SIRT6抑制HuH7细胞中的细胞克隆形成，而敲除SIRT6则显著促进克隆形成。（G） 细胞克隆形成的定量分析。（H）SIRT6在异种移植肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效，植入表达pcDNA3.1或pcDNA3.1-SIRT6的HuH7细胞。（I）每四天测量一次肿瘤大小，直到注射后34天。（J）每组的四个代表性异种移植肿瘤中SIRT6的免疫印迹分析。 （K）通过免疫组织化学分析的异种移植肿瘤组织中Ki-67表达的代表性图像。

在证实了SIRT6的缺失对小鼠和人类细胞系肝癌发展的影响后，SIRT6的过度表达也显示出细胞增殖受限。为研究SIRT6的过度表达是否会影响HCC肿瘤的生物学行为。因此，我们用稳定转染的HuH7-pcDNA3.1或HuH7-pcDNA3-SIRT6细胞建立异种移植小鼠模型。动物实验表明，SIRT6对异种移植物的形成和肿瘤生长有一定的抑制作用。同时，与pcDNA3.1-HuH7阴性对照相比，在pcDNA3-SIRT6异种移植物中，SIRT6蛋白水平保持显著高表达。我们还用增殖标记物Ki67对异种移植瘤组织进行染色，发现在SIRT6高表达组中，Ki-67表达下调。总的来说，这些数据表明SIRT6在HCC肿瘤生长中起着抑癌作用。

SIRT6通过抑制ERK1/2通路发挥抑癌作用：旨在研究SIRT6如何抑制小鼠和人类HCC细胞系中的肝肿瘤发生。 丝氨酸和苏氨酸激酶ERK1 / 2（细胞外信号调节激酶1和2）是丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）家族的成员，其失调有助于许多癌症的发展，包括HCC。据报道，MAPK信号通路是与SIRT6和癌症相关的一条重要途径。发现SIRT6基因敲除激活了ERK1/2通路，而SIRT6的过表达或选择性SIRT6激活剂MDL-800的激活显著抑制了HuH7细胞中ERK1/2的磷酸化。还研究了ERK1/2在HKO小鼠和肿瘤组织中的异常激活状态。推测SIRT6可能通过失活ERK1/2途径而抑制肝癌的发生。

图3、SIRT6缺乏诱导ERK1/2通路激活。（A–D）定量Western blot分析显示组中p-ERK和ERK的表达。组1:HuH7细胞在阴性对照组或SIRT6  shRNA中稳定表达。组2:转染pcDNA3.1或pcDNA3.1-SIRT6 72h后取细胞进行Western印迹。组3：用25μM MDL-800或溶媒对照处理48小时后，收集HuH7细胞进行蛋白质印迹。（E–F）使用正常WT和HKO小鼠的肝脏提取物以及化学诱导的肝细胞癌小鼠模型（分离的肿瘤结节）进行蛋白质印迹分析。

综上所述，研究表明小鼠肝脏特异性敲除SIRT6通过抑制ERK1/2信号通路促进肝脏肿瘤的发生和抗肿瘤作用。激活SIRT6与抑制ERK1 / 2活性相结合可以显著改善肝损伤和肝癌的治疗。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352304220301124