目前在肿瘤免疫疗法中，阻断免疫检查点是最有前景的疗法之一。其中，PD-1/PD-L1检查点是最广为研究的领域之一。程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)表达于活化T细胞表面，并能传导免疫信号抑制T细胞的增殖、生存和效应功能，影响T细胞的抗肿瘤效果。PD-1表达上调是T细胞活化的正常结果，也是终止免疫反应所必须的，但其异常高表达会过度抑制T细胞活性，因此维持PD-1蛋白水平在合适范围内是非常重要的。PD-1的表达是被多层级调控的，目前在翻译后水平调控方面，已知FBXO38能介导细胞表面的PD-1泛素化并通过泛素蛋白酶体途径使其降解[1]，但不知道在被转运至细胞表面前，是否还有调控机制参与胞内PD-1蛋白水平上的调控。此外，PD-1疗法还面临着耐药性和低响应率的问题。虽然5-FU与PD-1单抗联合疗法已被临床前研究数据证明有效，但它的具体机制尚不清楚。 

今年10月，北京大学基础医学院王嘉东教授、王巍教授团队和北京大学人民医院申占龙教授团队联合在著名SCI期刊PNAS上发表了题为“KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression”的文章[2]，揭示了一种可在翻译后水平上调控PD-1蛋白稳态的相关蛋白：KLHL22。它能在PD-1被转运至T细胞表面前介导其降解；而KLHL22的缺乏可导致PD-1异常高表达，T细胞活性被过度抑制，抗肿瘤反应降低。此外，该文章揭示化疗药物5-FU可通过抑制Klhl22转录来提高PD-1的表达量，从而增强5-FU和PD-1单抗联合疗法的效果。

KLHL22是一种主要的PD-1相关蛋白

为了探究蛋白质水平上PD-1的调控因子有哪些，研究人员首先在稳定表达PD-1的Jurkat细胞和HEK293T细胞上进行串联亲和纯化/质谱(Tandem affinity purification,TAP/MS)分析。在这两种细胞的TAP/MS结果中，他们发现KLHL22蛋白都得到了较高的特异性富集(>10%)。接下来，他们又做了免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)实验来验证KLHL22与PD-1间的结合作用，证明KLHL22是能与PD-1结合的蛋白质。

图1. KLHL22能与PD-1结合 

KLHL22缺失导致PD-1蛋白量上升

E3连接酶能特异性识别并泛素化底物，而被泛素化的蛋白质大部分都通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。而KLHL22是E3泛素连接酶BTB-CUL3-RBX1(BCR)复合体的一部分，因此，研究人员首先探究KLHL22能否影响PD-1降解。他们发现在Klhl22敲低的活化Jurkat细胞中，细胞表面PD-1蛋白水平升高，而PD-1在mRNA水平上并不受影响。此外，在Klhl22敲低的HEK293T细胞上也出现类似结果。为了进一步进行体内验证，研究人员使用了赛业生物构建的Klhl22敲除小鼠。研究结果发现敲除Klhl22并不影响T细胞的发育、外周稳态和活化。而且虽然编码PD-1的Pdcd1基因在转录水平上并没有发生变化，但Klhl22敲除小鼠体内CD8+T细胞和CD4+T细胞表面PD-1蛋白水平上升。这些数据与体外细胞实验数据一致，说明Klhl22敲低导致了PD-1蛋白量上升。

图2. Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠CD8+T细胞和CD4+T细胞表面PD-1蛋白水平

KLHL22在PD-1被转运至细胞表面前介导其降解

为了探究KLHL22介导的PD-1降解发生在哪个阶段，研究人员使用了蛋白转运抑制剂brefeldin A(BFA)来处理稳定表达PD-1的HEK293T细胞。BFA能特异性阻断蛋白质从内质网到高尔基体的转运过程。研究人员发现，在Western Blot结果中，BFA处理组出现了一条代表未完全糖基化的小分子量PD-1条带，且在Klhl22敲低的细胞中，未完全糖基化的PD-1蛋白比完全糖基化的PD-1蛋白浓度更高。此外，在小鼠模型上也有类似结果：与Klhl22 WT小鼠相比，Klhl22 KO小鼠体内淋巴结CD3+T细胞的高尔基体提取物中，未完全糖基化的PD-1蛋白量明显升高。这些结果显示KLHL22与未完全糖基化的PD-1相关。为了进一步验证这个结论，研究人员利用免疫沉淀实验检测KLHL22和未完全糖基化的PD-1蛋白是否能相互结合。结果显示，对比PD-L1，KLHL22和未完全糖基化的PD-1蛋白有更强的结合作用。此外，荧光检测共定位结果也表显示，BFA处理后，伴随着细胞表面PD-1蛋白的信号消失，胞内PD-1和KLHL22的重叠信号显著增强。这些数据都说明KLHL22是在PD-1被完全糖基化并转运至细胞表面前介导其降解。

图3. Klhl22和PD-1荧光检测共定位 

PD-1可被KLHL22/CUL3/RBX1泛素化

已知KLHL22是BCR E3泛素连接酶的底物特异性接头蛋白，能特异性识别底物并介导其泛素化。研究发现，用蛋白酶体(Proteasome)抑制剂MG132处理稳定表达PD-1的HEK293T细胞后，细胞内PD-1泛素化水平上升，而Klhl22敲低则显著降低了PD-1的泛素化水平。此外，免疫沉淀实验结果表明在CUL3、RBX1都存在的情况下，相比于无处理的对照组以及使用了突变KLHL22Δ6K转染的对照组，BFA处理加上Klhl22 WT的转染，能显著提升了PD-1的泛素化水平。为了进一步确认PD-1泛素化位点，研究人员首先使用了UBPred数据库来预测PD-1的赖氨酸残基，并通过泛素化实验进行确认，发现了K210和K233这两个未完全糖基化的PD-1蛋白的泛素化位点。

图4. KLHL22/CUL3/RBX1复合物能使PD-1泛素化. 

KLHL22通过降解PD-1增强肿瘤免疫效果

为了探究KLHL22在肿瘤免疫中的作用，研究人员在Klhl22 KO小鼠和Klhl22 WT小鼠体内分别接种了黑色素瘤细胞。结果显示，与Klhl22 WT小鼠相比，Klhl22 KO小鼠的肿瘤演进更快，且小鼠存活期更短。此外，Klhl22缺失不影响CD8+T细胞和CD4+T细胞，或是调节性T细胞(Treg)在肿瘤微环境中的比例，但肿瘤浸润CD8+T细胞和CD4+T细胞表面的PD-1水平在Klhl22 KO小鼠内明显上升，并且能产生IFN-γ、TNF和颗粒酶B的CD8+T细胞和CD4+T细胞数量显著下降，CD8+T细胞的增殖也受影响。这些结果显示在Klhl22 KO小鼠的肿瘤微环境中，CD8+T细胞和CD4+T细胞活性被过度抑制。为了进一步验证Klhl22 KO是通过PD-1来发挥作用，研究人员在皮下接种了肿瘤的Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠上进行了抗体阻断实验。结果显示，PD-1抗体的加入显著抑制了肿瘤增殖，消除了原本存在于Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠间的肿瘤生长差异。这些数据说明KLHL22的缺失能通过上调PD-1表达量使肿瘤浸润T细胞活性被过度抑制。

图5. PD-1抗体的加入消除了原本存在于Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠间的肿瘤生长差异

 T细胞活化信号和肿瘤微环境能调控KLHL22的表达量

为了验证KLHL22能否被TCR激活信号调控从而维持T细胞稳态，研究人员观察了Klhl22在静息态T细胞和活化T细胞的mRNA水平，发现T细胞活化后，Klhl22的mRNA水平显著提升。在加入了CD3/CD28抗体刺激的Jurkat细胞中也能发现相同的现象。此外，在结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)患者体内，对比临近的正常组织浸润T细胞，肿瘤浸润T细胞的KLHL22蛋白量大幅减少。这些结果显示T细胞激活导致的KLHL22表达量上升是一个维持PD-1蛋白水平稳态的机制；肿瘤微环境中这种机制的破坏是导致PD-1异常高表达和T细胞活性被过度抑制的原因之一。

图6. 在临近的正常组织浸润T细胞和CRC肿瘤浸润T细胞间KLHL22的表达差异 

5-FU通过抑制Klhl22转录来提高PD-1表达量

有很多临床和实验数据都表明化疗药物（例如5-FU）与PD-1单抗的联合治疗有协同效果，但具体机制仍不清楚。为了探究5-FU是否通过调控KLHL22表达从而影响PD-1，研究人员进行了qRT-PCR实验，发现5-FU降低了Klhl22转录水平的表达，并且可以在不影响PD-1 mRNA的水平上提高PD-1蛋白的表达量，而这种现象只在Klhl22 WT小鼠上出现。并且，5-FU对KLHL22蛋白表达量的抑制，PD-1蛋白表达量的提高呈现剂量依赖性。为了进一步探究5-FU如何影响KLHL22，研究人员进行了萤光素酶报告基因实验(Luciferase Assay)。实验显示Klhl22启动子上的一个小区域能有效启动Klhl22转录，且其转录活性在经5-FU处理后显著降低。这些数据表明5-FU能通过抑制Klhl22转录来下调其表达量，从而提高PD-1表达量，增强PD-1单抗效果。该机制与来源于CRC患者的临床数据相符。

图7. Klhl22调控PD-1蛋白表达量 

该文章揭示了胞内PD-1蛋白被转运至细胞表面之前由KLHL22蛋白介导的调控机制。KLHL22能识别未完全糖基化的PD-1，并介导其泛素化，使其通过泛素蛋白酶体途径降解，从而维持PD-1在细胞表面的蛋白水平稳态。此外，化疗药物5-FU处理可抑制KLHL22转录，提高PD-1的表达量，从而增强PD-1单抗的治疗效果。综上，该研究揭示了翻译后水平调控PD-1蛋白水平稳态的新机制，也为进一步应用发展5-FU和PD-1单抗联合疗法提供了理论基础。 

参考文献：

[1] X.Meng et al.,FBXO38 mediates PD-1 ubiquitination and regulates anti-tumour immunity of T cells.Nature 564:130–135(2018).

[2] X.A.Zhou et al.,KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression.PNAS 117(45):28239-28250(2020). 

原文检索：

[1] KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression.

DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2004570117.