主要穹窿蛋白非斑马鱼器官再生所必需

摘要：作为最大的细胞核糖核蛋白复合物的主要成分，进化高度保守的主要穹窿蛋白（MVP）已被提出在多个器官的再生中起着至关重要的作用。在当前研究中，使用最近产生的mvp敲除斑马鱼品系来表征器官再生过程中MVP的功能。发现mvp敲除斑马鱼保留了心脏，脊髓和鳍的再生能力。在受伤的mvp基因敲除斑马鱼中进行的进一步实验表明，细胞死亡会增加，而转录组的情况却基本保持不变。这些数据表明MVP在斑马鱼损伤反应的早期起到抗凋亡的作用，而在斑马鱼的再生过程中起着可忽视的作用。

关键词：主要穹窿蛋白  再生  斑马鱼 敲除 抗凋亡作用  生物科学 细胞生物学 细胞死亡 发育遗传学 再生医学

进化高度保守的主要穹窿蛋白（MVP）是最大的自然存在的核糖核蛋白的主要成分。研究表明，MVP与多种细胞过程的调控有关，包括核质运输，信号转导，细胞分化，细胞存活和免疫应答。由于大部分研究是在体外系统上进行的，因此在很大程度上MVP的生理作用仍然未知。虽然细胞穹窿的绝对功能尚未确定，但有报道认为这些核糖核蛋白可能在斑马鱼器官再生中起作用。表达分析显示，斑马鱼受伤后心脏、尾鳍和脊髓均有MVP表达。通过使用基于吗啉代的敲除方法，研究人员观察到脊髓横断后轴突再生减少，并提出MVP支持成年斑马鱼的运动恢复和轴突再生。在本研究中，我们建立了一个mvp基因敲除斑马鱼品系来描述mvp在器官再生过程中的功能。mvp-/-斑马鱼是可行的，没有明显的身体异常。数据表明，缺乏MVP不会导致斑马鱼心脏，脊髓和鳍的再生能力发生显著变化。进一步的实验表明，在受伤的mvp基因敲除斑马鱼中，细胞死亡显著增加，而转录组基本上没有改变。这些数据表明MVP在斑马鱼损伤反应的早期起到抗凋亡的作用，但在斑马鱼的再生过程中起着可忽视的作用。

再生过程中mvp的表达：为了更好地定义再生过程中mvp的时空表达模式，用含有斑马鱼mvp的BAC序列构建了mvp：EGFP报告株，并评估了受损心脏，脊髓和鳍中的EGFP信号。切除心尖后，24h内mvp驱动的EGFP在整个心室肌致密层被诱导。后3～7天，EGFP的反式激活被限制在心肌原始层，然后逐渐关闭。成年斑马鱼脊髓横断手术后24小时，中央管内壁的室管膜细胞中可观察到EGFP信号。随着再生过程的开始，EGFP的表达短暂扩展至损伤部位附近的神经元，并且在损伤后第7天（dpi）大部分消失。尾鳍截断术后约24小时，伤口表皮出现了明亮的EGFP信号。在胚泡形成过程中，mvp驱动的EGFP在胚盘间质中表达。在再生生长阶段，EGFP信号被抑制在新形成鳍远端边缘的非矿化针状体中。这些数据表明在急性反应阶段对损伤信号的mvp反应表达，因此MVP可能在多个器官再生的早期阶段调节炎症和细胞存活。

图1.斑马鱼器官再生过程中mvp的表达分析。 （A） mvp报告株转基因结构示意图。 （B–D）mvp：EGFP在指定时间点在心脏，脊髓和鳍中的表达。 B中上面箭头表示心室壁致密层有表达。下面箭头表示心肌原始层的表达。. C中的星号表示受伤部位。

mvp基因敲除斑马鱼：为了阐明mvp在再生中的功能，使用了CRISPR-Cas9来破坏斑马鱼mvp基因。设计了多个靶向mvp位点的sgRNAs，转录并注射到1细胞期斑马鱼胚胎中。F1代与野生型AB鱼杂交，并筛选是否存在整个mvp编码区的缺失。选择在mvp基因座上缺失22,490-bp的等位基因用于后续分析。为了证实敲除系中mvp的丢失，通过qPCR和全套原位杂交检测mvp的表达，验证了mvp-/-胚胎中不存在mvp mRNA。收集了多个mvp +/- incrosses胚胎，并将其饲养到成年阶段，以研究mvp在斑马鱼发育，存活和繁殖力中的作用。在mvp-/-和野生型动物之间未观察到形态上的差异。与mvp基因敲除小鼠相似，在mvp-/-鱼中未观察到对总体存活和繁殖力的显著影响，因此mvp突变鱼提供了研究其再生功能的机会。

图2. 构建mvp敲除斑马鱼品系。 （A）斑马鱼mvp基因组位点和Cas9 / sgRNA靶向位点。Δ22,490等位基因中的缺失显示为破折号。 （B）原位杂交和qPCR结果显示在mvp敲除胚胎中不存在mvp mRNA。C）在指定时间点的对照和mvp-/-斑马鱼的实时图像。（D）来自三个独立实验之一的mvp-/-鱼和同伴的代表性Kaplan-Meier图。（E）对照和mvp-/-斑马鱼的繁殖力和交配效率。

mvp丢失对器官再生的影响：在最常用的心室切除鱼研究中分析了mvp丢失对心脏再生的影响。损伤后，斑马鱼的心脏对整个器官产生损伤反应，心外膜被激活并在心肌再生中起重要的结构和信号传导作用。使用tcf21：nucEGFP转基因品系观察心外膜细胞的行为，结果在对照和mvp-/-动物中均显示，心室周围的心外膜细胞受到损伤的刺激而增殖，并在损伤后7天（dpa）合并到下面的心肌壁中。为了确定mvp的丧失是否影响斑马鱼心脏的再生能力，我们检查了心肌细胞增殖，疤痕组织去除和肌肉恢复。在所有情况下，mvp-/-和野生型动物之间均未观察到显著差异。这些结果表明，mvp–/−斑马鱼的心脏再生能力没有改变。

图3. mvp KO鱼的心脏再生。 （A）对照和mvp-/-鱼中心外膜细胞的可视化。（B）对照和mvp-/-动物在心室切除后第7天（dpa）心肌细胞增殖，通过Mef2和PCNA染色进行评估。C） 指定时间点的心室切片图像，评估心肌（MHC）的恢复和疤痕组织（纤维蛋白，胶原蛋白）的消除。

据报道，吗啉代对斑马鱼中MVP的抑制作用导致脊髓损伤后轴突再生减少。为了探讨mvp是否影响中枢神经系统再生，研究了斑马鱼脊髓横断模型中轴突再生和运动恢复。斑马鱼的中枢神经系统再生是在神经祖细胞活化和增殖后通过新生神经发生的。为了测试再生细胞增殖是否需要MVP，我们定量了受损脊髓的细胞增殖，而mvp-/-和野生型动物之间没有观察到显著差异。利用乙酰化α-微管蛋白免疫组织化学方法，在受伤后30天（dpi）在绝大多数野生型和mvp-/-样品中横切位点中观察到了再生轴突。通过轴突投射逆行追踪，证实了两种类型的脊髓的头端和尾部残端的重新连接。鱼的运动活动被作为功能恢复的一个指标进行评估。数据显示野生型对照组和mvp−/−鱼在30 dpi时恢复了伤前游泳性能。以上结果表明，MVP的缺失对斑马鱼脊髓再生无明显影响。

 图4. mvp KO鱼中的脊髓再生。 （A）损伤后第7天（dpi），对照组和mvp-/-动物中神经细胞的增殖，通过PCNA染色评估。

然后，研究了mvp-/-斑马鱼鳍再生的关键过程在mvp-/-动物中，间质区域的细胞增殖与野生型相当。为了进一步检查mvp-/-鱼的鳍再生能力，截断了野生型和mvp-/-鱼的尾鳍，并连续监测了14天新鳍组织的生长程度。mvp-/-鱼的再生速率与野生型相似。

mvp基因敲除斑马鱼细胞死亡及转录组的变化：与人类一样，损伤会导致快速的局部组织坏死并触发斑马鱼的细胞凋亡。越来越多的证据表明，MVP通过调节凋亡调节基因（如Bcl-2）的表达而参与细胞存活。因此，我们检测了受损心脏和脊髓中的细胞凋亡，TUNEL分析显示这两种组织中的细胞死亡在mvp–/−鱼中显著增强。以前的结果表明再生能力在mvp敲除斑马鱼中得以保留，通过RNA-seq分析了野生型和mvp-/-动物再生心脏中转录组的变化检查再生程序是否被改变。 PCA分析显示转录组的分布与心脏再生状态密切相关，这表明mvp-/-动物对再生信号的响应与野生型相似。斑马鱼心脏再生是一个高度动态的过程，涉及多个信号和因素，构成了一个复杂的再生程序。检查了再生相关基因的表达，发现其中大多数在mvp-/-动物中表现出与野生型相似的反式激活水平。总之，这些数据表明MVP在损伤反应的早期阶段起到抗凋亡的作用，MVP的丢失对心脏的再生程序没有明显的影响。

讨论：本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了MVP基因敲除斑马鱼品系。MVP的整个编码区（约22kb）被敲除，在敲除动物中未检测到mvp mRNA，因此等位基因为真正的无效等位基因。和哺乳动物一样，穹窿在硬骨动物的发育和正常环境下的细胞过程中并没有扮演重要的角色。数据进一步表明，在损伤诱导的细胞应激下，穹窿参与了细胞存活所需的机制。这一结果与所分析的三种组织在损伤反应急性期mvp被反式激活的观察结果一致。mvp敲除斑马鱼中发现了广泛的细胞死亡，未检测到对再生的长期影响。对这一观察结果的可能解释是，斑马鱼的非凡再生能力使细胞的过度丢失得到了充分的补充。研究具有有限再生能力的动物中mvp的损失对器官再生/组织修复的影响是很有趣的。 由于MVP基因敲除小鼠是可行的，所以这种类型的实验是可行的且能提供参考。除了MVP外，穹窿还包含其他两种蛋白质TEP1和VPARP，以及一种非编码RNA（vRNA）。据报道，在斑马鱼中，MVP通过限制TBK1的活化而成为IFN产生的负调节剂。转录组数据显示受伤的mvp基因敲除鱼的炎症强度没有明显改变。需要进行更系统的分析来阐明mvp在各种情况下对免疫应答的作用。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844020322659