WZSP近交系成年体重仅为30～35kg，是正常猪体重的15％～30％，为探讨其矮小机理，对 WZSP近交系内分泌生长轴上的生长激素基因、生长激素受体基因及胰岛素样生长因子I基因进行了克隆和序列分析，将为研究WZSP近交系矮小的分子机理奠定基础。

(一)实验材料

实验所用材料为近交F16 WZSP的脑垂体、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肌肉组织，取自中国农业科学院畜牧研究所五指山猪保种场。活体屠宰后，用干净的手术刀从相应的组织上切下大小合适的组织块，用灭菌的纱布包裹，做好标记后立即放入液氮中保存备用。大白猪cDNA样品获赠自方华。实验研究采用分子遗传学的常规仪器和试剂，如德国Eppendorf梯度PCR扩增仪、英骏公司的ABI 3730自动测序仪，菌株由本实验室保存的克隆菌DH5a，所用的质粒pGEM®-T Easy vector为Promega公司产品等。主要试剂100bp ladder、1kb ladder DNA分子量标准和蛋白质分子量标准均购自鼎国公司；质粒小量提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自北京天根生物公司等。

(二)实验方法

1.总RNA的提取、检测和DNase-I处理

(1)组织中总RNA提取  总RNA采用Invitrogen公司的Triml® Reagent提取，具体操作步骤如下：

①取出保存的适量组织样，放入盛有液氮的研钵中研成粉末，称取0.05～0.19的粉末于1.5mL的EP管中，加入1mL TRIZOL，剧烈振荡后，15～30℃温育5min。

②加入0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s后于15～30℃温育3min。

③将离心管置于冷冻离心机2～8℃10000r/min离心15min，小心吸取上清液转入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于15～30℃温育15min以沉淀总RNA。

④将离心管置于冷冻离心机2～8℃10000r/min离心15min，弃上清液。

⑤加入1ml。用冰预冷的75％乙醇漂洗，2～8℃ 7500r/min离心5min，弃上清液，于室温干燥10min。

⑥提取的总RNA溶于20μL DEPC处理过的水，并取出1μL用Jenway GENOVA核酸蛋白分析仪测定总RNA浓度，余下样品于-20℃保存备用。

(2)总RNA完整性检测  用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，具体操作如下：

①制备1.5％甲醛凝胶：将1.5g琼脂糖溶于63mL DEOC处理水，冷却至60℃，加入20ml 5×甲醛凝胶电泳缓冲液和17mL 37％的甲醛，混匀后在通风橱内灌制凝胶，于室温放置30min，使凝胶凝固。

②制备总RNA样品：在一灭过菌的0.5mL的微量离心管中混合1μL总RNA，2μL 5×甲醛凝胶电泳缓冲液，3.5μL 37％的甲醛和14μL去离子甲酰胺，于65℃水中温育15min，冰浴冷却，稍加离心使管内液体集中于管底。往管中加入2μL凝胶上样缓冲液和1μL 1mg/mL的EB溶液，混匀。

③电泳：将已凝固的凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，5V/cm预电泳5min，然后将已制备好的总RNA样品加入点样孔，5V/cm电泳，1h结束电泳，用凝胶成像系统记录电泳图像。

(3)总RNA的DNase-I处理  为避免总RNA中残留的DNA对RT-PCR的影响，用DNase-I处理总RNA，去除残余的基因组DNA。具体方法如下：

①在0.5mL的离心管中加入50μg总RNA、10μL DNase-I(10U/μL)与1μL RNasin(40U/μL)，混匀后于37℃水浴温育30min。

②取出离心管稍加离心，加入等体积的苯酚：氯仿混合液(体积比为3：1)，混匀后冰浴20min。

③于10000r/min离心10min，吸取上清液加入另一0.5mL离心管中，随后加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L乙酸钠(pH4.0)，混匀后于-20℃放置1h以沉淀总RNA。

④然后10000r/min离心10min，弃上清液，用预冷的75％乙醇漂洗RNA沉淀，置室温下干燥10min，然后溶于适量双蒸馏水中。

2.反转录、扩增检测

(1)反转录  在一灭过菌的0.2mL的微量离心管中加入2μg DNase-I处理过的总RNA与0.5μg锚定引物，于70℃温育5min以解开总RNA的二级结构，迅速转入冰浴以防二级结构的再次生成。将离心管稍加离心后顺次加入：10μL 5×反转录缓冲液，2.5μL 10mmol/L dNTP mix，1μL RNasin和1.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，用DEPC处理水将终体积补至50μL，混匀离心后于37℃温育1h，再在95℃温育5min以灭活反转录酶。反转录后的cDNA可于-20℃保存3个月。

(2)PCR扩增  根据GeneBank中猪GH基因、GHR基因和IGF-I基因的序列(登录号分别为 X53325，NM214254，NM214256)运用引物设计软件Primer 5.0设计特异性引物，以组织中提取的总 RNA的反转录产物cDNA为模板进行扩增。

WZSP GH基因PCR反应体系：2.5μL 10×Buffer，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，2μL dNTPs(2.5mmol/L)，0.125μL Ex Taq，1μL DNA模板，ddH2O补足至25μL。

WZSP GHR基因PCR反应体系：2.5μL 10×Buffer，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，4μL dNTPs(2.5mmol/L)，0.25μL LA Taq，1μL DNA模板，ddH2O补足至25μL。

WZSP IGF-I基因PCR反应体系：2.5μL 10×Buffer，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，2μLdNTPs(2.5mmol/L)，0.125μL Ex Taq，1μL DNA模板，ddH2O补足至25μL。

经过梯度PCR扩增仪对各个引物退火温度的摸索，确立了PCR反应程序：

PGH的反应程序为：94℃预变性5min→94℃变性30s→58℃退火30s→72℃延伸1min(30cycles)

→72℃延伸10min→4℃保存。

PGHR的反应程序为：94℃预变性5min→94℃变性1min→52℃退火30s→72℃延伸2min

(30cycles)→72℃延伸10min→4℃保存。

PIGF-I的反应程序为：94℃预变性5min→94℃变性30s→52.5℃退火30s→72℃延伸1min(30cycles)→72℃延伸7min→4℃保存。

PCR反应程序结束后，1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物(表1-46)。

3.PCR产物的纯化、克隆与测序

(1)琼脂糖凝胶中回收纯化PCR产物  进行克隆测序前，若扩增产物的目的带电泳后并不是很亮(或杂带较亮)则需要进行凝胶纯化回收。在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，接下来按照试剂盒说明书操作。

(2)纯化PCR产物与pGEM-T Easy载体的连接  直接将特异扩增产物或凝胶纯化产物与pGEM- T-easy载体进行连接。连接反应体系为5μL，其中包括2.5μL 2×Buffer，0.5μL的T-easy载体，1.5μL的纯化PCR产物，0.5μL的T4连接酶，然后将装有连接体系的1.5mL Ependorff管放入恒温循环仪4℃水浴过夜。

(3)大肠杆菌感受态细胞的制备  从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个大肠杆菌单菌落接种于2mL LB中，于37℃振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mL LB的锥形瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待0D600达到0.3～0.4时将锥形瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入50mL离心管中于4℃ 4000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，4℃ 4000g再离心10min，用4mL冰预冷的0.1mol/L的 CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。

(4)连接产物的转化  如需进行蓝/白斑筛选，则在转化前30min于LB平板上涂40μL 20mg/mL X-gal和4μL 10mg/mL IPTG，正置于37℃温箱中，使X-gal和IPTG得到充分吸收。无菌状态下取100～150μL感受态细胞加入到上述装有连接产物的1.5mL Ependorff管中混匀，在冰上放置25min，42℃热激1min，其间不要晃动Ependorff管，取出后冰浴2min，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1.5h。取100μL涂布于含有IPTG和X-gal的LB固体平板上，37℃平放1h后倒置培养，10h后即可观察到有蓝色和白色菌斑长出。

(5)重组质粒的快速鉴定：

①菌落PCR方法：用无菌牙签或小枪头挑取细菌转化子，一起放入含有LB培养基的EP管中，37℃快摇直到有云雾状出现(5h)，以菌液为模板，用扩增该DNA片段的引物进行PCR，同时以DNA样品、水分别作为阳、阴性对照。当扩增出与阳性对照大小一致的片段时，即可能为阳性克隆。

(2)Cracking鉴定法：若插入片段过长(3kb以上)，此时进行菌落PCR并不容易，则挑取转化子培养后，取400μL至EP管中，高速离心5min，去尽上清液，加入30μL 2×Cracking Buffer，37℃水浴15min，再高速离心15min，取20μL于1.0％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，紫外灯下观察结果。

(6)序列测定  每个片段均可采用PCR产物直接测序和克隆测序两种方法。但直接测序对于PCR产物的质量要求比较高(无杂带，产量高)。克隆测序是挑取单个克隆子用于测序，序列测定由Invitrogen北京分公司完成，每个基因片段至少测两个克隆子。

核酸序列分析软件为DNAstar、DNAMAN，引物设计软件Primer premier 5.0。

(三)结果和分析

1.总RNA的甲醛变性凝胶电泳检测结果  从WZSP近交系的各种组织器官中提取总RNA，经过甲醛变性凝胶电泳检测结果如图1-42所示，图中显示出总RNA的28S和18S两条带都比较清晰的结果，28S和18S带的比值约为2：1，经Jenway GENOVA核酸蛋白分析仪检测 A260/280比值在1.8～2.0，表明所提取的总RNA无降解，纯度高，完整性较好，可以作为反转录反应模板并用于后续实验。

2.五指山猪近交系GH、GHR和IGF-I基因cDNA的获得

(1)五指山猪近交系GH基因cDNA的扩增  以WZSP近交系脑垂体总RNA反转录产物cDNA为模板，采用特异性引物PGHF、PGHR进行PCR扩增，其结果如图1-43所示。PCR扩增产物大小为732bp，从图中可以看出该扩增产物比较特异，可以直接克隆测序。

(2)五指山猪近交系GHR基因cDNA的扩增  以WZSP近交系肝脏总RNA反转录产物cDNA为模板，采用特异性引物PGHRF、PGHRR进行PCR扩增，其结果如图1-44所示。PCR扩增产物大小为1937bp，从图中可以看出该扩增产物比较特异，可以直接克隆测序。

另外，本试验以大白猪的肝脏组织反转录产物和WZSP近交系的心脏、肺脏和肌肉组织的反转录产物为模板，扩增得到GHR基因，如图1-45所示。

(3)五指山猪近交系IGF-I基因cDNA的扩增  以WZSP近交系脾脏总RNA反转录产物cDNA为模板，采用特异性引物 PIGF-IF、PIGF-IR进行PCR扩增，其结果如图1-46所示。 PCR扩增产物大小为525bp，从图中可以看出该扩增产物比较特异，可以直接克隆测序。

3.五指山猪近交系GH、GHR和IGF-I基因的克隆测序

WZSP近交系GH、GHR和IGF-I基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶纯化后连接入pGEM T-easy载体，蓝白斑筛选。限制性内切酶EfoRI酶切鉴定阳性克隆，如图1-47，图1-48和图1-49所示。阳性克隆经菌液PCR和酶切鉴定后，取1mL菌液送In-vitrogen英骏公司测序。

4.五指山猪近交系GH、GHR和IGF-I基因的序列分析

(1)五指山猪近交系GH基因cDNA的特征  引物PGHF、PGHR进行PCR扩增所获得的WZSP近交系GH基因的片段长732bp，包含编码区651bp，已将该序列提交给GeneBank数据库(GeneBank收录号：DQ415717)。该编码区编码一个拥有216个氨基酸的蛋白质(图1-50)，其分子量为24400，等电点(PI)为7.175。将该基因的编码区在GeneBank中进行同源性搜索，与猪GH基因高度同源达99％，另外发现其编码区cDNA序列与犬GH基因cDNA(GeneBank收录号： NM001003168)有93％的同源性，且长度相同。除此之外，WZSP近交系的GH编码区cDNA序列与其他物种也均有较高的相似性，与猫、牛、绵羊、小鼠、人分别具有93％、91％、90％、87％、82％的同源性。

WZSP近交系GH基因编码区推导蛋白的氨基酸序列与普通猪GH基因(GeneBank登录号： X53325)推导蛋白的氨基酸序列进行比对发现：9号位置WZSP近交系发生氨基酸替换，缬氨酸替换丙氨酸(A→V)，22号位置WZSP近交系发生氨基酸替换，谷氨酰胺替换精氨酸(R→Q)(图1-51)。

(2)五指山猪近交系GHR基因cDNA的特征  WZSP GHR蛋白经过Blast P(NCBI Conserved Domain Search)分析表明，该蛋白质序列存在着一个保守的结构域FN3(149～250aa，见图1-52)，该结构域是血纤连蛋白内部重复的一种类型，其内部结构包含一个RGD细胞识别序列。大约2％的动物蛋白均包含FN3结构域，另外在细菌糖基水解酶中也发现FN3结构域。FN3位于细胞因子受体结构域的β折叠，同纤维连接蛋白和免疫球蛋白超家族结构域十分相似，它们可能都来自同一祖先基因。在大多数情况下，细胞因子受体结构域与FN3结构域成串排列。

特异性引物PGHRF、PGHRR进行PCR扩增所获得的WZSP近交系GHR基因的片段长1937bp，包含编码区1917bp，已将该序列提交给GeneBank数据库(GeneBank收录号：DQ422962)。该编码区编码一个拥有638个氨基酸的蛋白质(图1-53)，其分子量为71100，等电点(PI)为4.509，是一个偏酸性蛋白质。将该基因的编码区在GeneBank中进行同源性搜索，与猪GHR基因高度同源达99％，另外发现其编码区cDNA序列与绵羊GHR基因cDNA(GeneBank收录号：NM001009323)有91％的同源性。除此之外，WZSP近交系的GHR编码区cDNA序列与其他物种也均有较高的相似性，与牛、犬、人、小鼠分别具有90％、90％、89％、83％的同源性。

WZSP近交系GHR基因编码区推导蛋白的氨基酸序列与普通猪GHR基因(GeneBank登录号： NM214254)推导蛋白的氨基酸序列进行比对发现：381号位置天冬氨酸替换谷氨酸(E→D)；409号位置丝氨酸替换丙氨酸(A→S)；556号位置缬氨酸替换亮氨酸(L→V)；580号位置甘氨酸替换丙氨酸(A→G)；601号位置异亮氨酸替换缬氨酸(V→I)(图1-54)。

但是本试验将克隆的大白猪的GHR基因编码区推导蛋白氨基酸序列与WZSP近交系肝脏、心脏、肌肉和肺脏组织的GHR进行比对发现：55号位置赖氨酸替换谷氨酰胺(Q→K)，165号位置苏氨酸替换丙氨酸(A→T)，281号位置异亮氨酸替换精氨酸(R→I)，601号位置异亮氨酸替换缬氨酸(V→I)(图1-55)。

(3)五指山猪近交系IGF-I基因cDNA的特征  从脾脏组织总RNA反转录产物采用特异性引物 PIGF-IF和PIGF-IR扩增出的PCR产物，大小为525bp，包含编码区393bp(图1-56)。该编码区189号位置发现一个G→A突变，该突变是一个同义突变(图1-57)，未引起所编码氨基酸的变化。该基因的编码区编码一个130个氨基酸的1GF-I前体蛋白，分子量为14400，等电点为9.144，是一个偏碱性蛋白。

(四)讨论

1.五指山猪近交系GH基因  对猪GH基因的研究始于1983年Seeburg等对猪GH基因的cDNA成功克隆，全基因序列于1987年由Vize等人确定，目前发现猪GH基因全长2231bp，由5个外显子和4个内含子构成，1993年由Yerle等人将猪GH基因定位于12P1.2～P1.5。近几年来，国内外学者已经对猪GH基因结构做出了大量基础性工作，多为分析DNA水平上猪GH基因PCR产物的多态性。 Soren等人率先用传统RFLP技术发现丹麦4个猪种GH基因Dra I酶切多态位点，Nielson等又验证了这一结果。Kirpatrick等用PCR-RFLPs技术研究发现了pGH基因的HaeⅡ和MspⅠ多态位点。Larsen等分析了丹麦4个猪种pGH基因-119～+486位的片段，发现ApaⅠ在+299处，CfoⅠ在+330和+379处存在切点。Balatskzi发现大白猪和Mirgorod猪pGH基因+298位存在BsuRⅠ切点。姜志华等对pGH基因的PCR产物进行了序列分析，发现了外显子2上4处碱基替换能引起氨基酸变化。宋成义等、陶勇等分别采用PCR-RFLPs方法检测了姜曲海猪GH基因+206～+711区段中MspⅠ和 ApaⅠ酶切位点多态性，以及姜曲海、长白、小梅山、皮特兰、杜洛克等5个猪品种在-119～+486区段均存在BspⅠ、HhaⅠ酶切位点多态性。综合以上研究，部分PGH基因限制性多态位点如图1-58所示。本研究所克隆得到的WZSP近交系GH仅在信号肽区存在2个氨基酸残基的差异，成熟肽区没有发现氨基酸的替换，这说明GH的保守性较强，也可能与WZSP近交系的高度近交选育有关。

2.五指山猪近交系GHR基因  GH与GHR结合，受体二聚化和酪氨酸磷酸化，细胞中产生IGF-Ⅰ，而后产生特异生化反应(GH信号转导)。这个过程非常精细和复杂，其中GHR位于内分泌生长轴的中心，起到传递GH促生长效应的关键作用。GHR的分子多态性可能导致动物生长发育模式的变异，例如人类的Laron综合征，近年通过对Laron综合征分子病理学研究，其病因已经明确。Laron综合征是GHR分子结构缺陷，或者信号转录异常(受体后缺陷)所造成的常染色体隐性遗传病(Rosenfeld and Vivian, 2004)。GHR广泛存在于各种组织和细胞内，组织中GHR量的多少、功能的正常与否将影响GH生理效应的发挥。如果GHR缺失或发生缺陷，会阻断GH信号传导途径产生GH不敏感性和导致GH缺乏综合征。但目前还有相当多的Laron综合征患者并未证实GHR基因有缺陷，推测其缺陷可能发生在受体表达过程的某个环节或受体后信息转导成分，这些均有待于进一步的研究证实。还有禽类的性连锁矮小鸡(SLD)的不同品系中已检测出至少4种GHR分子多态性(Burnside等，1991)，这可能是导致SLD鸡个体矮小，体重轻的主要原因。因此GHR的分子结构具有极其重要的作用。

本研究中克隆的WZSP近交系GHR基因编码区推导蛋白的氨基酸序列与普通猪GHR基因(GeneBank登录号：NM214254)推导蛋白的氨基酸序列进行比对发现了5处氨基酸替换，这些氨基酸替换均位于GHR的胞内结构域，可能会影响到GHR下游的信号转导；而将大白猪的GHR与WZSP近交系比对发现了4处氨基酸替换，其中165号位置的氨基酸替换位于GHR的FN3保守结构域中，推测该氨基酸替换可能对GHR的结构和功能产生重要的影响作用。值得注意的是，601号位置的氨基酸替换可能是WZSP近交系所特有的。上述情况的出现可能是品系不同或五指山猪近交选育的结果。至于这些氨基酸替换是否会影响到GHR的信号转导需要进一步的研究。

3.五指山猪近交系IGF-1基因  胰岛素样生长因子-Ⅰ是胰岛素样生长因子家族中的一员，因氨基酸序列与胰岛素原高度同源(49％)而得名(Rinderknecht and Humbel, 1978)。胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链碱性多肽，分子量约为7500。猪胰岛素样生长因子-Ⅰ(pIGF-Ⅰ)基因由6个外显子和5个内含子组成，全长80kb(Samaras等，1996)。Winter等(1994)以重复序列(CA)19为引物，将IGF-Ⅰ基因定位于猪5号染色体的q23-24上，并得到了一个线性连锁图谱：Sw1071-IFNG-S0015-MHC-IGF1一Sw995-Sw967(Winter等，1994)。pIGF-Ⅰ的生物学功能主要包括介导生长激素的促生长作用，促进体脂的合成、乳腺和卵巢的发育，以及促进某些性腺分泌性激素。研究发现，在猪的IGF-Ⅰ基因位点上不同个体、不同品种间存在着丰富的多态性。在IGF-Ⅰ基因上游约1200bp处，经微卫星标记检测发现6个等位基因突变(124、130、132、134、136和138bp)，并且品种间基因频率差异极显著(Kirkpatrick, 1992)。方美英等和王文君等对 IGF-Ⅰ扩增产物进行限制性内切酶酶切，发现2个Hha Ⅰ酶切位点，其中1个位点产生多态，共产生2个等位基因A(151+28)和B(116+35+28)，且多个猪种间存在基因频率的差异(方美英等，1999；王文君等，2002)。目前，通过候选基因法研究发现猪IGF-Ⅰ基因对生长速度和胴体组成有主效作用。本研究克隆的WZSP近交系IGF-Ⅰ基因仅在编码区发现一个同义突变，但未引起氨基酸的变化，对成熟IGF-Ⅰ的功能没有影响。