斑马鱼模型：破解黑色素瘤的细胞状态和可塑性

摘要：动态细胞异质性是黑色素瘤进展和治疗耐药性的原因。单细胞技术的进步揭示了黑色素瘤中越来越多的肿瘤和微环境细胞状态，但对它们在体内的功能却知之甚少。斑马鱼模型是用于发现，实时成像和研究黑色素瘤进展和治疗过程中细胞状态的强大系统。通过捕获活体动物中动态的黑色素瘤状态，斑马鱼具有解决黑色素瘤异质性复杂性的潜力，该异质性从单个细胞一直到整个体内的疾病过程，揭示了新颖的癌症生物学和治疗靶标。黑色素瘤在肿瘤内异质性和克隆形成潜力方面是所有癌症中最高的，其特点是预后不良。异质性源于疾病发展过程中获得的遗传突变的组合以及非遗传因素的变异，例如基因转录和代谢。黑色素瘤的转录状态可以反映神经嵴、黑素母细胞或色素黑素细胞的发育轨迹，以及与谱系无关的状态，如压力或饥饿状态。异质性的另一层源于肿瘤内细胞周期动力学的差异，其中一些种群活跃地循环，而其他种群则是缓慢循环或休眠的，这些种群还可以表现出干细胞特性。更复杂的是，黑色素瘤细胞状态显示出可塑性，可以从一种状态过渡到另一种状态。了解转录状态如何影响个体患者的黑色素瘤进展对于药物开发至关重要，也是开发个性化治疗方案的重要一步。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的最新进展提供了一种探索肿瘤内异质性程度的有效方法。使用scRNA-seq分析，Tirosh及其同事证明了黑色素瘤肿瘤细胞的转录组沿双极表达模式排列，未经处理的肿瘤主要在一端表达MITF程序基因，BRAF / MEK抑制剂治疗的黑色素瘤细胞在另一端表达丰富的AXL程序基因。由此MITF基因表达程序可直接分化（MITF高），增殖（MITF中度）和浸润（MITF低）细胞状态，以及MITF低/ AXL高细胞状态显示药物 抵抗性。短期患者来源培养物中的scRNA-seq研究进一步验证了这些程序，并增加了多样性，包括基质和氧化磷酸化标记。现在越来越明显的是，除了极端的黑素细胞和间充质细胞状态外，黑素瘤细胞状态还可以沿着该轨迹在动态光谱中发现，穿过一个或多个中间细胞状态，甚至向内皮谱系转分化。从我们的角度来看，斑马鱼是一个强大的晶状体，通过它我们可以解决复杂的黑色素瘤瘤内异质性。与人类皮肤相似，斑马鱼黑素细胞在斑马鱼的表皮基底层被发现，人类和斑马鱼之间共享着许多黑素细胞的发育生物学。转基因和基因编辑技术在斑马鱼中得到高度发展，可在单个细胞水平上进行比较的肿瘤基因组学，高级成像和生物过程的功能操纵。基于基因工程和移植的斑马鱼癌症化身正在开发与临床相关的皮肤黑色素瘤模型，以及罕见的黑色素瘤亚型，例如葡萄膜和粘膜黑色素瘤。斑马鱼已经成为一种非常成功的表型药物筛选模型，尤其是通过筛选黑素细胞发育谱系。

图1.斑马鱼工具来解锁黑色素瘤细胞状态。斑马鱼是解决黑色素瘤异质性和可塑性的有力模型。并行研究发育谱系（左）和黑色素瘤的起始和残留疾病模型（右），可以在复杂的微环境中同时筛选黑色素瘤并进行详细的单细胞和功能分析。介绍了评估黑素瘤细胞状态，可塑性和微环境因素各个方面的各种技术示例。

斑马鱼黑素瘤中的scRNA-seq：

斑马鱼黑色素瘤模型的scRNA序列揭示了特定于神经嵴黑色素细胞谱系的癌细胞状态，以及那些延伸到神经嵴黑色素细胞谱系之外并被其他癌症类型共享的癌细胞状态。最近建立了以MITF低和MITF高转录为特征的BRAF突变体和BRAF非依赖性黑色素瘤模型。低MITF斑马鱼黑色素瘤与MITF低黑色素瘤患者具有相同的转录状态，这是一种以不良预后为特征的黑色素瘤亚型。通过scRNA-seq分析，我们验证了黑色素瘤的转录组分类，因此，单细胞水平上的状态可以反映肿瘤样本的特征。此外，White、Yanai及其同事最近报道BRAFV600Ep53突变型黑色素瘤有三种转录状态：黑素细胞、神经嵴和应激样，后者表现为泛癌细胞状态。在治疗转变和疾病消退时捕捉黑色素瘤的脆弱性是很重要的。Marine实验室和我们自己的实验室使用scRNA测序来解决最小残留疾病（MRD）阶段的黑色素瘤细胞动力学，在原本无病的组织中存在持久性细胞，而它们倾向于或获得肿瘤复发的特性。这些研究揭示了MRD位点细胞出乎意料的复杂性，表明多种细胞状态共存。值得注意的是，在PDX模型中由BRAF / MEK靶向治疗产生的持久性细胞与在斑马鱼中的MITF谱系依赖性所产生的持久性细胞之间共享侵袭性细胞状态，这表明在黑色素瘤消退和大块肿瘤塌陷过程中出现了共同的去分化细胞状态。我们的模型进一步确定了原发性肿瘤中残留疾病中的G0样细胞群，回溯其他人在黑色素瘤和其他癌症类型中发现的G0样细胞群。慢周期细胞群，其中一些表达表观遗传修饰因子，包括jarid1b，表明表观遗传控制转录机制是持久性癌细胞状态的基础。功能分析表明，这些细胞是持续细胞生长所必需的，并在药物治疗后出现，而且即使在此状态下，某些细胞仍具有高度侵袭性，但尚未发现这些细胞如何促进黑素瘤复发。总之，这些模型提供了强有力的证据，证明斑马鱼体内的细胞状态与人类癌症状态相同，包括G0样、侵袭性和色素沉着状态。

活体细胞亚群成像：细胞亚群及其与周围微环境的关系的动态可视化对于理解肿瘤的演变以及从一种细胞状态到另一种细胞状态的表型转换至关重要。斑马鱼的胚胎是透明的，能够在延长的时间段内以单个细胞分辨率进行发育，致癌性转化以及与邻近细胞的相互作用的实时成像。斑马鱼的免疫系统对人类来说是保守的，斑马鱼的黑色素瘤研究开始纳入免疫反应的组成部分。例如，feng等人是第一个使用斑马鱼胚胎实时成像技术发现免疫系统可以在黑素瘤发展的最早阶段识别出转化的RAS突变黑素细胞。

斑马鱼发育谱系和黑色素瘤模型的平行研究使我们对黑色素瘤的谱系失调有了更深入的了解。实时成像一直是这些研究的核心。White，Zon和他的同事揭示了在黑色素瘤发生过程中神经嵴的表达特征重新出现，这导致了第一个针对黑色素瘤细胞转录延长的临床试验。通过实时成像，Kaufman等人进一步利用神经嵴特异性谱系转基因来证明，在癌变区域内，只有重新获得早期神经嵴特征的细胞才会进化为恶性群体。White及其同事使用透明的成年斑马鱼，捕获了一些最早的转移性黑素瘤细胞群。成年鱼的实时成像对于在原位残留疾病位点捕获黑色素瘤细胞亚群也至关重要，它提供了内源性MRD位点内持续性细胞的最初图像。这些研究说明了斑马鱼系统的一个特殊优势：能够通过实时成像将从固定时间点捕获的scRNA-seq细胞状态信息与黑色素瘤细胞在其自身微环境中的动态变化联系起来。

图2、斑马鱼黑色素瘤细胞状态的成像实例。（a） 斑马鱼黑色素瘤的捕获。表达神经嵴转基因crestin：EGFP的黑色素瘤易感斑马鱼能随着时间的推移追踪黑色素瘤的发生和肿瘤的生长。b） 可视化最小残留病（MRD）。斑马鱼原发性黑色素瘤和MRD的亮场和荧光图像。（c） 细胞状态间的表型合作。斑马鱼胚胎移植后两种荧光黑色素瘤细胞系的同种异种移植。异种异体移植物显示协同迁移。

黑色素瘤亚群和微环境的功能分析：需要对新细胞群和细胞状态对黑素瘤预后的作用进行功能验证和测试。单个细胞的状态，以及肿瘤微环境的组成部分，可以通过使用荧光标记基因进行实验性的改变和追踪。基于斑马鱼的平台可实现组织特异性和快速的基因过度表达，编辑或电穿孔，从而可以在空间和时间上控制基因的表达。与遗传学，药物治疗和实时成像相结合时，斑马鱼可以为胚胎期和成年期的异种移植提供一个可操作的模型。类似于小鼠PDX模型，可以将人或斑马鱼黑素瘤细胞移植到具有功能性先天免疫的斑马鱼胚胎中，或者移植到免疫功能低下的透明成年斑马鱼中，并随时间推移进行追踪。Hurlstone及其同事利用异种移植来发现表型不同的细胞之间的合作以促进黑色素瘤转移，这种现象称为合作性侵袭。此外，White等人通过将黑色素瘤细胞移植到斑马鱼早期胚胎中，证明了从scRNA-seq分析得到的细胞状态转录特征与其生物学功能之间的直接联系。研究表明黑色素瘤亚群在产生新的肿瘤和提供BRAF/MEK抑制剂抵抗方面最为强大。在微环境中，与癌症相关的细胞群对黑素瘤的生长产生了深远的影响，可以在斑马鱼模型中进行功能验证和机理探索。例如，使用外源性内皮素3（EDN3）肽和edn3b突变体，Kim和同事发现黑色素瘤EDN3微环境控制表型向增殖和分化状态转变。Zhang和他的同事证明，癌症相关的脂肪细胞直接将脂质转移到斑马鱼黑色素瘤中以促进生长。Ferreira等人构建了tert突变嵌合斑马鱼，以证明端粒短的非癌细胞能促进衰老和炎症，从而以非细胞自主方式促进黑色素瘤。此类功能性检测与用于成像和基因编辑平台的报告基因系相结合，为揭示活体动物复杂微环境中癌症相关细胞群新生物学特性提供了工具。

结论：针对黑色素瘤细胞状态和亚群的药物已经出现。斑马鱼是在体内重建黑色素瘤肿瘤的强大模型系统，是靶向黑色素瘤细胞状态并在治疗过程中追踪这些细胞命运的表型药物筛选的独特平台。随着单细胞组学技术（如RNA、DNA、甲基化DNA或开放染色质位置测序）的发展，正准备利用斑马鱼对整个生物体内黑色素瘤进展和治疗的突变和转录动力学进行分类。将单细胞RNA-seq与空间转录组学相结合的第一个例子已经在肿瘤的形态学背景下确定了耐药细胞群。结合活体成像，这些技术将是一个强有力的方法来捕捉随着时间的流逝，以及随后的治疗，肿瘤细胞群如何相互作用以及如何与肿瘤结构内的微环境相互影响。尽管斑马鱼系统具有研究细胞异质性的潜力，但仍然存在一些挑战。成年斑马鱼的活体成像仍然受分辨率和可行性的限制，成年斑马鱼的谱系追踪和位点特异性基因编辑技术非常规。但是，展望未来，我们将能够将scRNA-seq与基于DNA突变的谱系追踪相结合，以追踪克隆进化并整合蛋白质组学和代谢组学。基因编辑和组织特异性细胞消融技术将进一步帮助研究细胞状态和类型的功能，并验证药物靶点。最终目标是能更好地预测患者的病情并发现最能满足患者需求的新疗法。