摘要：最近在多发性硬化和哮喘小鼠模型中证实了抗炎肽TnP的有效性。本研究以斑马鱼为模型，在毒理学研究性试验中对TnP的安全性进行了评价。进行了OECD#236试验，研究TnP对斑马鱼胚胎存活、孵化性能和形态形成的影响。分析评价斑马鱼幼虫的运动、心跳率，以确定不良反应，如神经毒性和心脏毒性。结果表明，1 nM至10 μM为 TnP的非致死和安全剂量范围，无神经毒性或心脏毒性作用。TnP能穿过血脑屏障，而没有干扰前脑，中脑和后脑的正常结构。数据强化了斑马鱼作为一种精确的毒理学研究模型的重要性，可以在临床前阶段评估分子的急性毒性以及心脏毒性和神经毒性。

关键词：TnP肽  临床前分析 毒理学评估  斑马鱼 药物安全性

简介：斑马鱼毒理学临床前筛选除了具有形态学特征的优点外，与其他替代性试验相比，还具有保守生理和代谢功能。MS研究的挑战之一是了解髓鞘再生过程的缺点以及制定恢复髓鞘再生的策略。我们的研究小组开展了一项大型研究，证明TnP对于开发有效的药物控制MS神经炎症和预防脱髓鞘具有重要的特性。我们发现皮下TnP治疗（预防性、治疗性或连续治疗）成功地改善了MOG诱导的EAE（实验性自身免疫性脑脊髓炎）临床症状的严重程度，这是一种具有良好特征的MS小鼠模型，延迟了最大症状的出现（4天），与溶媒对照EAE小鼠相比，将症状的严重程度降低了40%。TnP通过部分依赖于IL-10的机制在多个阶段有利地干扰免疫回路：1） 抑制树突状细胞（DC）的激活状态，并在EAE诱导阶段提供浆细胞样DC和调节细胞的出现；2） 通过抑制MMP-9活性和CD18表达阻断白细胞向中枢神经系统（CNS）的转运和浸润；3） 阻断中枢神经系统中致病性Th1或Th17淋巴细胞的活化和持久性。4） 防止巨噬细胞在中枢神经系统的浸润；5）有利于调节性T细胞的局部增加；在药物研发中，在动物试验中，百分之九十八的化合物最终在临床试验之前被废弃。在大多数情况下，这是因为该化合物在体内没有表现出足够的治疗活性（功效），或者在临床开发过程中产生了不良影响，因此被认为是不安全的。虽然已经证明了TnP对复杂免疫回路的有效性，但在准确的临床前毒理学研究中评价TnP的安全性是当务之急。非哺乳动物脊椎动物斑马鱼模型具有减少时间和成本的潜力，适用于早期临床前药物发现的高通量药物筛选或评估候选治疗药物并满足制药行业的特定法规要求。斑马鱼毒理学临床前筛选除了具有形态学特征的优势外，还具有生理和代谢保守的优势。使用完整的动物作为筛选重点的优势在发现神经内科药物时尤为明显，其中细胞间相互作用和内分泌信号传导的复杂性极具挑战性。尽管存在有关TnP的生化和治疗特性的许多发现，但我们尚未进行体内模型毒性评估的研究。因此本研究的目的是利用斑马鱼作为毒理学临床前研究的模式生物，评价前药TnP的安全性和生物分布，揭示其毒性机制，降低临床前和临床后期失败的风险。

斑马鱼麻醉与安乐死：在分析前，将幼虫浸泡在2毫升含0.4%三卡因的E2  0.5x培养基中2分钟进行麻醉。在实验结束时，通过将其浸入含4％三卡因的E2 0.5x培养基进行安乐死。暴露后，在莱卡（M205C）体视显微镜下观察幼虫心跳停止的情况，然后将其置于10%漂白溶液中。

TnP对斑马鱼生存发育的干扰评价：鱼胚胎急性毒性（FET）试验：将受精后4小时内的胚胎（hpf）置于24孔微孔板（每孔5个胚胎，一式四份），暴露于2ml不含或不同TnP剂量（0.001、0.01、0.1、1、10、100、1,000和10,000μm）的E2 0.5x培养基中，并在暴露后24、48、72和96 h进行分析。在徕卡M205C立体显微镜下评估死亡率（卵子凝固），每天计数死亡个体，无需更换溶液。

基于表型的筛选：在存活的个体中，畸形的发生，如体节缺失和尾部不分离（致死参数）、头/眼畸形、卵黄囊吸收异常、心包水肿、卵黄囊水肿、色素沉着异常（亚致死参数）；在徕卡M205C体视显微镜下对弯曲尾、短尾、脊柱畸形和生长迟缓（致畸参数）进行注释和拍照。

幼虫体长：将暴露于TnP急性毒性环境下存活的96 hpf幼虫置于玻璃皿中横向排列，测量其总体长。使用Leica M205C立体显微镜获得的图像，利用Leica Application Suite软件对幼虫进行头顶到尾端测量。

心脏毒性和心包面积测量：用0.00075%N-苯基硫脲对不超过2hpf的胚胎处理6h，以避免产生色素的细胞分化。1 dpf时将其麻醉并在0.02的链霉菌素中浸泡5分钟使之脱绒。用E2 0.5x培养基洗涤后，将所得幼虫分配到24孔板中（每孔5个胚胎，一式四份），浸入不含或含0.001、0.01、0.1、1和10μM剂量TnP的E2 0.5x培养基中。在不更换培养基的情况下，每暴露24h后麻醉一次并进行连续3天分析。计数心跳并在Leica M205C立体显微镜下以50x对暴露72h的幼虫进行拍摄。使用ImageJ v.1.8.0_172软件测量不同组幼虫的心包总面积。

TnP分布：根据制造商的说明，使用EIT-Label FITC蛋白标记试剂盒将TnP与FITC（异硫氰酸荧光素）偶联。根据Komegae等人的研究，TnP与FITC的偶联通过LCsingle-bondMS得到证实，并在Sep-Pak-light-TC18柱中分离。使用Eppendorf InjectMan®4微型注射器，将2−3 nL 的FITC或1.2 ng /nL（7.9 μM）TnP- FITC注入 2hpf胚胎的卵黄中，在Leica M205C立体显微镜上进行显微注射。

斑马鱼运动行为评估：根据Ulhaq等人的描述，TnP可能的神经毒性作用由144 hpf斑马鱼幼虫的游泳行为确定。将获得的胚胎保存在含有10ml新鲜的E20.5×培养基的培养皿中，直至6dpf。将每只幼虫（24只/组）添加到96孔板的单孔中，该孔含有200μL E2 0.5x培养基，不含或含剂量为0.001、0.01和0.1μM的 TnP。适应30分钟后，将96孔板置入ZebraBox系统，在交替的10min/明/暗期间应用跟踪设置。通过Viewpoint的ZebraLab™软件对运动活动进行定量和分析。

TnP对脑形态发育的影响：为了测试TnP对斑马鱼大脑发育的潜在影响，使用Eppendorf InjectMan®4微型注射器，将2−3 nL 0.01 μM 的TnP微量注射到0 hpf胚胎的卵黄中，在28和48 hpf下用明场显微镜成像的大体形态分析畸形。在徕卡M205C体视显微镜下进行显微注射，在半固体琼脂糖平板麻醉下，测量前脑、中脑和后脑的前后和水平长度。

结果：非致死剂量TnP对斑马鱼胚胎异常发生率的影响：TnP的急性毒性基于卵凝固和胚胎和仔鱼的死亡率， 0 hpf斑马鱼胚胎暴露在一定剂量范围内（1 nM至10 mM）的TnP，每24 h至96 h评估一次。图1A中的结果表明，与仅暴露于E2 0.5×培养基的对照胚胎的90%存活率相比，1000和10000μM的最高剂量足以在暴露的前24小时促进100%的胚胎死亡率。重要的是，与对照胚胎相比，从1 nM到100TμM的各种TnP剂量都不会引起存活率的变化，并且一直存活到96 hpf。

图1、TnP具有广泛的安全和非致死剂量范围，从1 nM到10μM。

在寻找非致死剂量TnP暴露4天后（96 hpf），不更新E2 0.5x培养基，诱导的基于表型的畸形时，分析了胚胎的亚致死性（卵黄水肿、心包水肿、眼/头畸形和孵化延迟）和致畸性（生长迟缓、脊柱畸形、钩状，短而弯曲的尾巴）。我们观察到随着TnP剂量的增加促进了异常发生率的增加。最低剂量的TnP（0.001μM）仅引起弯曲尾的出现（9个有1个报告缺陷），100μM的最高剂量引起亚致死性和致畸性缺陷（9个有8个报告缺陷），但没有引起钩尾异常。0.001μM剂量致弯尾率19%，0.01μM剂量致未孵化胚胎率12%，1μM剂量致脊柱畸形率11%，100μM剂量致未孵化胚胎率12%，心包水肿率10%，卵黄水肿率27%。结果显示，几乎所有剂量的TnP都会导致弯曲的尾巴、脊柱畸形和卵黄水肿：分别为6（0.001–100μM）、5（0.01–100μM）和4（0.1–100μM）；图1C显示了暴露在100μM剂量的TnP的斑马鱼个体缺陷的代表性图像。

暴露于TnP的斑马鱼胚胎的表型筛选：为了研究TnP对生长的影响，在96 hpf时测定了幼虫的体长。我们观察到与未进行TnP处理的对照幼虫相比，最低剂量（0.001和0.01μM）TnP暴露能够刺激幼虫长度增加6.5％。另一方面，与对照组相比，在最高剂量（100μM）时，96 hpf幼虫的体长略减少了7％。0.1、1或10μM剂量TnP暴露均未改变标准长度。

图2.暴露于TnP的96 hpf斑马鱼的幼虫体长。

由大体形态分析显示，剂量为100、10和1μM的TnP诱发心包水肿，与卵黄囊水肿一起代表了典型的“蓝囊综合征”，如Hill等人所述，下一步是测量心包区域的延伸，以了解TnP的毒性机制。0.001–1μM剂量的TnP不会增加心包面积。然而，与对照幼虫相比，仅最高剂量的TnP（10μM）使心包面积增加了8.4%。心脏发育受损可导致血液循环减少、心腔充血、心率减慢而无收缩。然后，根据MacRae&Fishman的心搏计数来评估10μM剂量是否会影响1dpf胚胎的心功能。我们观察到从2到4 dpf对照组幼虫的心跳正常增加，在最后一天达到27次/15秒。用10μM的TnP处理后，我们发现相同的心率模式，，TnP处理的幼虫心率与对照相比没有差异。

结果表明，10μM剂量的TnP增加心包面积（8.4％）引起的轻度毒性作用并未反映出心脏功能障碍。

TnP穿过血脑屏障但不引起神经毒性作用：我们分析了TnP是否可以通过血脑屏障（BBB）转运。24、48和72hpi时通过荧光信号（FITC）观察在2hpf注入胚胎卵黄的TnP-FITC的组织分布。未注射的幼虫在24、48或72hpi时不呈现绿色荧光。注射到卵黄24小时后，TnP-FITC仅出现在微注射部位。然而，在48hpi时，在斑马鱼脑中证实了TnP-FITC的存在，与幼虫卵黄中的FITC浓度形成对比。在72 hpi时，在注射TnP-FITC的胚胎中观察到轻微的荧光信号。

图3、通过荧光动力学测定斑马鱼体内的TnP分布。光运动反应分析，包括自动跟踪幼虫在交替光照条件下的运动，被广泛用于筛选神经毒性效应。亮暗过渡会增加运动活动，而暗亮过渡会降低运动活动。

斑马鱼的主要结构有前脑、中脑和后脑。根据Lowery＆Sive，在28或48 hpf循环开始前后测量前脑，中脑或后脑的长度。与未注射对照胚胎相比，经TnP处理的胚胎在28或48 hpf时前脑、中脑和后脑的长度未观察到变化，表明TnP对大脑生长没有影响。

研究结果证实了神经炎性疾病候选药物TnP的广泛治疗指标，强调斑马鱼作为毒理学研究模型的重要性，以评估临床前发育阶段分子的急性毒性、心脏毒性和神经毒性。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214750020304467