摘要：精神科药物是人类处方的主要药物之一，它们在水生环境中的存在引起了人们对非目标生物潜在危害的担忧。去甲替林（NTP）是一种选择性的5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂抗抑郁药，广泛用于临床和环境水基质中。在这项研究中，我们评估了NTP对斑马鱼胚胎和幼体早期阶段的毒性作用。对暴露于浓度为500至46900µg/L的NTP中168h的斑马鱼进行发育和死亡率分析。通过将胚胎/幼虫暴露于较低的NTP浓度（0.006–500µg/L）来评估运动行为和乙酰胆碱酯酶（AChE）活性。暴露168h后的半数致死NTP浓度为2190µg/L。尽管我们在治疗组中未发现显著的发育变化，但暴露于≥500µg/L NTP的存活幼虫中已经明显缺乏平衡。行为分析表明，即使在极低的环境相关浓度（0.006和0.088µg/L）下，NTP也能改变斑马鱼幼虫的游泳行为。我们观察到暴露于500µg/L NTP的动物中的乙酰胆碱酯酶活性显著降低。结果强调了NTP对斑马鱼早期生命阶段的急性毒性作用。最重要的是，暴露于与环境相关的NTP浓度可能会影响斑马鱼幼虫的运动行为，进而降低物种的适应性。有必要进行更多涉及慢性暴露和敏感终点的研究，以更好地了解NTP在更现实的暴露情况下的作用。

关键词：斑马鱼  去甲替林  鱼胚胎毒性试验  乙酰胆碱酯酶活性  行为测试

简介：大量的抗抑郁药已经在多种水基质、污泥和水生生物的生物组织中被鉴定出来。抗抑郁药以其特定的作用方式而闻名，许多研究表明，这种药物可能在水生生物中引起副作用，包括侵略性降低，生育能力和发育受到干扰以及摄食活性受到抑制。去甲替林（NTP）是一种三环类抗抑郁药（TCA），用于治疗抑郁症、焦虑症、进食障碍和疼痛综合征。NTP被归类为5-羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI），因为它可以防止突触前5-羟色胺再吸收并导致突触后受体激活增加。NTP和其他三氯乙酸（TCA）可以在废水处理厂中通过吸附在活性污泥上进行去除，去除效率约为75％。由于清除不彻底，因此三氯乙酸不断流入水生环境。NTP在水生基质中的持久性可能是由于其有限的水解性和生物降解性。迄今为止，只有1项研究评估了NTP对非目标水生生物（鲤鱼）的潜在负面影响。结果表明，NTP及其混合物可能会损害鱼类的早期生命，增加死亡率，并诱发形态异常，组织病理学变化和脂质过氧化。由于文献稀少，需要更多关于NTP暴露的毒理作用的信息，尤其是在鱼类中。斑马鱼被广泛用作毒理学和环境健康研究的模型生物。 有趣的是，斑马鱼拥有所有经典的神经递质，包括血清素能和胆碱能系统，这使得该动物适合研究作用于此类系统的物质，例如抗抑郁药。最近，de Farias等人发现低浓度氟西汀会损害乙酰胆碱酯酶活性（≥0.88μg/L）和斑马鱼幼鱼的游泳行为（≥6μg/L）。此外，据报道，安非他酮（一种去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂）在浓度> 44 mg / L时会影响斑马鱼的胚胎发育（孵化延迟，水肿和尾巴畸形）。在这种情况下，本研究旨在采用多个终点（死亡率、胚胎发育、乙酰胆碱酯酶活性和运动行为）的综合方法评估NTP对斑马鱼胚胎和仔鱼的毒性，其中包括与环境相关的NTP浓度和与生态相关的敏感参数。

鱼胚胎毒性试验：根据预试验的结果，选择了7种不同的浓度（500、1100、2300、4800、10,300、22,000和46,900 µg / L），并通过连续稀释NTP储备液来制备。试验在每个处理组中使用60个胚胎，分为3个重复，选择并分布在24孔微孔板中。用2ml测试液填充20个孔，用水填充4个孔（内板对照）。试验在受精后90分钟内开始，持续168小时。将胚胎和幼虫保存在培养箱中，以保持最佳实验条件，仅将其取出用于日常的体视显微镜分析。此外，在96小时后更新溶液一次，以确保整个暴露期间的水质和NTP分子的存在。孵化前，评估以下参数：卵凝固、耳石形成不足、发育迟缓、眼睛和/或身体色素沉着不足、体节形成不足、心跳不足、水肿、尾芽与卵黄囊脱离不足、卵黄囊吸收不足和孵化不足。孵化后，还检查了脊柱畸形、水肿、鱼鳔膨胀和缺乏平衡（表现为活孵化胚胎侧躺在微孔板底部，对机械刺激缺乏反应）。所有参数均按观察值或未观察值进行评估和量化。

运动行为分析：为了分析斑马鱼的运动反应，选择了一系列浓度，包括更贴近现实的环境浓度（0.006；0.088；1.58；28.12；500µg/L）。这些浓度是根据FET结果和以前的文献选择的。斑马鱼胚胎分布在96孔板（每孔1个）中，并暴露在与FET所述相似的条件下。在NTP暴露120、144和168h后，对每个处理（包括对照组在内的16个胚胎的3个重复）总共48个胚胎的运动进行评估。在行为评估之前，死亡的幼虫或表现出身体异常的幼虫被排除，不分析。幼虫的运动是用斑马箱跟踪系统进行评估的，该系统配备了一个每秒25帧的红外摄像机，持续评估20分钟。温度稳定保持在26±1℃。该测试包括使胚胎在光照下适应5分钟，然后经过10分钟的黑暗期和另外5分钟的光照期。. 测量的行为终点包括：总游泳距离（TSD）、总游泳时间（TST）、慢动作（SM）和快动作（FM）的百分比。相对SM（%）是每个测量周期内移动的慢距离和总距离之间的比例，而相对FM（%）是每个测量周期内移动的快距离和总距离之间的比例。采用5mm/s的阈值区分SM和FM。

生化生物标志物分析：为了分析神经内分泌生物标记物乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，对斑马鱼胚胎进行了毒性试验，使用与运动行为试验相同的亚致死浓度范围：0.006、0.088、1.58、28.12和500µg/L。试验在1L烧杯中进行，烧杯中装满500 mL试验溶液和250个胚胎。孵育120、144和168小时后，用0.5 mL K-磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.4）将10池15个活孵化胚胎/幼虫收集到微管中，在液氮中冷冻，并立即在−80°C下储存至分析当天。在乙酰胆碱酯酶活性测定之前，样品在冰上解冻，使用超声波仪进行均质，并在10000 g下离心20分钟。分离得到的线粒体后上清液，并将40µL每个样品移液到96孔微孔板中进行酶测定。

结果：鱼胚胎毒性试验：图1显示了暴露于7种NTP浓度（500至-46,900 µg / L）168小时后斑马鱼胚胎/幼虫死亡率的累积百分比。暴露48 h后，两个最高NTP浓度（22,000和46,900 µg / L）对胚胎完全致死。 所有浓度的胚胎都在孵化前死亡。对于2300、4800和10,300 µg / L NTP浓度，死亡率是渐进的，并随着暴露时间的增加而增加。在4800 µg / L NTP下，几乎所有的胚胎在72 h后都会孵化，但是在144 h后没有生物存活。同样，对于10,300 µg / L NTP，孵化率在72 h后为〜50％，但是在暴露120 h后死亡率达到100％。另一方面，较低的NTP浓度（500和1100 µg / L）与对照组的曲线相似，在168小时后死亡率极低。正如预期的那样，LC50（导致50%死亡率的暴露浓度）表明，随着暴露时间的增加，胚胎/幼虫对NTP变得更加敏感；因此，我们观察到168h后的最低LC50（2190µg/L）。与对照组相比，NTP组在孵化和发育过程中的变化（如尾部形成、卵黄囊吸收、脊柱畸形等）无显著性差异。图2A和B分别显示正常胚胎和幼虫，没有明显的形态畸形。唯一值得注意的亚致死参数是缺乏平衡（图2C，D和图3）。 缺乏平衡的幼虫表现为未充气（图2C）和充气的鱼鳔（图2D）。

图1、在168h暴露期间，去甲替林（NTP）对斑马鱼生命早期阶段的影响概述。 死亡，活的和孵化生物的比例用不同的彩色条表示。

图2、从鱼胚胎毒性（FET）试验中获得的斑马鱼胚胎和幼虫的代表性图像。（A） 正常胚胎，（B）正常幼虫，（C-D）缺乏平衡的幼虫。sd：不充气的鱼鳔。每张图片中都显示了去甲替林（NTP）的浓度，以及所用的曝光时间和放大倍数。

图3、去甲替林（NTP）对斑马鱼幼虫在96～168小时暴露期间缺乏平衡的影响。

在NTP暴露96h后，与对照组相比，在1100、2300和4800μg/ L NTP样品中已经观察到平衡变化。在最低浓度（500 µg/L）下，与对照相比，暴露144 h后观察到缺乏平衡的幼虫。尽管在统计学上不显著，但在暴露于所有4种低浓度受试物120 h后，也发现平衡变化增加。同样，在168 h之后，在NTP浓度为500、1100和2300µg / L时，幼虫的平衡有所改变，但是与对照组相比，只有1100µg / L的数据才有意义。计算了平衡缺失的EC50。96 h后，缺乏平衡的EC50为1247 µg/L。

运动行为分析：斑马鱼实验结果表明，NTP暴露引起斑马鱼幼虫在黑暗期游泳活动的变化。关于TSD，暴露于500µg/L NTP的幼虫在120、144和168小时后的总移动距离显著低于对照组。与对照组相比，暴露于28.12µg/L NTP的生物体在144和168小时后TSD也显著降低。相反，与对照组相比，暴露于0.088µg/L NTP的生物体在144小时后TSD显著增加。与对照组相比，在144和168 h后暴露于28.12μg/ L NTP的幼虫以及在120和144 h后暴露于500µg / L NTP幼虫的TST均显著降低。还发现，与对照组相比，暴露于最低NTP浓度（0.006µg/L）的动物在144小时后TST显著下降。

图4、在黑暗中暴露于去甲替林（NTP）后，斑马鱼幼虫的总游泳距离（TSD）和总游泳时间（TST）。

图5、黑暗中去甲替林（NTP）对斑马鱼幼虫慢距离移动率（SM）和快距离移动率（FM）的影响。

在NTP暴露后，幼虫的行为，就缓慢和快速移动而言也发生了变化。我们观察到，与对照组相比，暴露于最低NTP浓度（0.006µg/L）的幼虫在120、144和168小时后SM减少，FM增加。与对照相比，但仅在暴露120 h后，在0.088μg/ L时也检测到SM显着降低和FM升高。与对照相比，在168µh暴露后，仅以500µg / L NTP观察到SM的增加和FM的减少。

生化生物标志物分析：NTP对暴露幼虫AChE酶活性有抑制作用。与对照组相比，在120、144和168小时后，500µg/L时对酶活性的抑制更为一致。与对照组相比在较低浓度下，尤其是在0.088和1.58 µg/L浓度下，仅在168 h NTP暴露后观察到乙酰胆碱酯酶活性降低。

图6、去甲替林（NTP）对斑马鱼幼虫乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的影响。

结论：据我们所知，这是第一项使用多级评估方法研究NTP对斑马鱼生命早期阶段可能产生的不利影响的研究。FET试验表明，NTP浓度≥4800µg/L暴露144 h后，死亡率为100%。虽然我们没有观察到显著的发育变化，但存活的幼虫在≥ 500µg/L NTP浓度下明显缺乏平衡。运动试验显示，非常低的NTP浓度（0.006和0.088µg/L）能够损害斑马鱼的游泳行为。此外，生化分析表明，浓度≥500µg/L时，乙酰胆碱酯酶活性的降低可能有助于干扰斑马鱼幼虫的运动行为。总的来说，结果表明短期的NTP暴露对斑马鱼胚胎/幼虫是有毒的。值得关注的是，我们观察到与环境相关的NTP浓度下的行为毒性，表明非常低的药物浓度会对环境中非靶生物的存活率产生负面影响。为了更好地了解NTP在更现实的暴露场景下的毒性作用，有必要使用慢性暴露和更具体的终点进行进一步的研究。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651320317048