(一)材料和方法

WZSP近交系60头，采自中国农业科学院畜牧研究所试验猪场，耳组织样液氮保存备用。按照常规方法进行猪耳组织基因组DNA提取、DNA浓度和纯度的检测和琼脂糖凝胶电泳检测。经过PCR扩增SLA-Ⅱ DRA、DRB、DQA、DqB基因的第二外显子、SSCP检测，PCR产物直接测序等方法。及利用DNAstar软件拼接序列，进行相似度检测，确定突变位点的碱基类型；用MEGA3软件ClualW比对所得序列与部分HLA等位基因，并构建NJ(邻接法)系统树及Bootstrap Values检测系统树的可靠性。同源性序列比较：登录NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi，用BLAST将所得序列与GeneBank数据库中已有序列进行比较。

(二)SLA-DRA、DRB基因的多态性研究结果与分析

1.五指山猪近交系基因组DNA提取结果  检测结果如下图1-74所示。

2.PCR扩增结果  在五指山猪近交系基因组DNA中SLA-DRA-Exon2和SLA-DRB-Exon2的扩增出约为233bp和245bp左右的特异带，结果见图1-75和图1-76所示。

3. SSCP电泳结果分析  60头WZSP近交系SLA-DRA-Exon2和SLA-DRB-Exon2的SSCP结果(图1-77和图1-78)分别表明，在WZSP近交系群体中，各分别存在2个等位基因。

4.直接测序法(DS)  本实验SLA-DRA基因选择1、48号个体和SLA-DRB基因选择6、9号个体，由上海博亚生物技术有限公司双向直接测序，经SeqMan拼接得到SLA-DRA、DRB外显子2序列，该等位基因的比对结果见图1-79所示(下划线部分为引物序列)。

5.结果分析

(1)SLA-DRA基因分析  本研究所得到的SLA-DRA基因外显子2的核苷酸序列之间和GeneBank中所有的SLA-DRA等位基因序列进行比对分析，结果表明，SLA-DRA基因外显子2保守性很强；且2个等位基因在GeneBank中都存在，24号个体中的等位基因与登录号为AY243102的一致，48号个体的等位基因与登录号为AY191779的一致。其突变是在对应的cDNA序列的309位上发生G/T颠换。可以引起一个氨基酸(X/M)的改变。与人HLA-DRA比较，发现在核苷酸水平同源性为87.1％，在氨基酸水平同源性为83.4％，特别是猪DRA序列中α1功能区肽结合槽的氨基酸残基与人HLA-DRA具有许多相同的残基。且与人CD4分子相互作用的第124位和136位氨基酸并没有发生变异。

(2)SLA-DRB基因分析  将所得的DRB等位基因外显子2的核苷酸序列进行比对分析，结果表明，在五指山猪近交系群体中，有2个等位基因，且二者仅有88％的同源性。在对应的cDNA序列的145、146、147、148、265、266、268、287、292、293、309、312、322等位点的核苷酸碱基发生变异。与GeneBank中所有的SLA-DRB基因比对分析，发现有新的突变位点，分别在278、279、280、281等连续4个碱基突变。该新等位基因序列及氨基酸序列分别与NIH小型猪DRB-C和DRB-D基因及氨基酸序列比较，发现在核苷酸水平上同源性为86％和88％，在氨基酸水平上同源性为77％和81％，与在中国人群中频率较高的HLA-DRB*09012和HLA-DRB*1201基因的氨基酸序列比较，其同源性分别为78％和72％。DRB两个等位基因与SLA-DRB-C、SLA-DRB-D、HLA-DRB*09012、HLA-DRB*1201外显子2核苷酸比对结果见图1-80所示。

(3)SLA-DRB外显子2系统树的构建  用MEGA3软件中的ClualW比对和采用Tamura-Nei距离下的NJ聚类法(Bootstrap抽样1000次)对所能得到的SLA-DRB等位基因序列与部分HLA等位基因序列进行分析，如图1-81所示。

从图1-81可以明显发现。WZSP-SLA-DRB-6很容易与SLA-DRB*4、SLA-DRB*KB01聚合在一起，且Bootstrap Values为100；WZSP-SLA-DRB-48与SLA-DRB*3聚合为一类，Bootstrap Values为98。二者的都很高，表明该聚类有较强的可靠性。根据系统树上标记Bootstrap Values，又可把其分为三大类群即SLA1、SLA2、HLA，而五指山猪近交系仅有的两个等位基因分别分布在SLA1和SLA2这两大群中。同时用距离间的标准误来检测分类的可靠性。数据见表1-50所示。

各群体间标准误＜5％，表明SLA1、SLA2、HLA之间差异显著，充分证明了该分类的可靠性。从下面的辐射聚类图(图1-82)也可以看出明显分为这三大类。同时还可看出，红色SLA2区域和HLA在进化上有较近的关系。

(三)SLA-DQA、DQB基因多态性研究结果与分析

1. SLA-DQA、DQB-Exon2 PCR扩增结果扩增SLA-DQA、DQB第2外显子，分别获得228bp和237bp特异性片断(图1-83、图1-84)。

2. SLA-DQA、DQB-Exon2 SSCP检测结果  经PCR-SSCP方法检测突变位点，由图1-85和图1-86初步判定，在五指山猪近交系群体中，SLA—DQA第2外显子存在突变位点，SLA-DQB没有多态。

3. SLA-DQA、DQB—Exon2的测序  为确定PCR-SSCP检测结果的可靠性，分别挑选三种不同带型片断的个体，直接测序，发现在五指山猪群体中第116位点存在碱基的颠换(A/C)，发生了错义突变，引起氨基酸的改变(K/Q)(图1-87、图1-88)。

(四)讨论

由于猪的原产地或品种不同，各类猪的SLA分子多态性分布也呈现出地域特征。五指山猪近交系群体是产于海南山区的一种小型猪，长期封闭繁育造成个体间的高度近交。Q wu等(2004)采用RT-PCR技术克隆测序得五指山猪近交系DRA和DRB基因位点序列且发现了新等位基因，但并没有公布新等位基因的核苷酸序列，她所获得的新等位基因是否和笔者得到的一致，这还有待于以后证实。但是，她在文章中与我国南方人群的HLA高频等位基因HLA-DRA*0101的氨基酸比较，发现其同源性分别为83.07％；与HLA-DRB*09012、HLA-DRB*11011、HLA-DRB*1201的氨基酸比较，发现其同源性73％左右，与本实验只对其外显子2序列所编码的氨基酸序列的同源性比较结果87％和75％左右比较一致。

SLA-DRB外显子2的邻接法聚类图显示，从物种进化的角度分析，猪的SLA-DRB基因最初是由两个等位基因突变分化成两大群等位基因，而WZSP近交系仅有的两个等位基因分别分布在这两大群中，表明就 DRB位点，近交并没有使五指山猪近交系群体丢失最基本两大类中的任何一方，WZSP近交系群体遗传资源的全面性和可代表性，这为五指山猪近交系群体MHC特异单倍型的培育提供很好的理论基础。