(一)材料与方法

根据实验结果，选择携带纯合SLA-DRB新等位基因的近交系WZSP2头，由中国农业科学院畜牧研究所试验猪场提供。采集其耳组织样，液氮保存。采用反转录PCR、克隆、测序等方法获得SLA-DRB新等位基因cDNA序列。

(二)结果与分析

(1)RNA的完整性  如图1-89所示。

(2)RT-PCR扩增产物特异性鉴定  利用SLA-DRB引物，在五指山猪cDNA中扩增出一条长度约为810bp左右的特异带，1.5％琼脂糖电泳检测，结果见图1-90所示。

(3)PCR扩增产物克隆  将回收扩增产物与pGEM-T Easy Vector连接，转化大肠杆菌DH5a受体菌，涂布到含50mg/mL Amp的LB平板上，获得阳性重组质。

(4)质粒酶切鉴定  对重组子DNA用EcoRⅠ酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果证明目的基因DNA片段成功插入质粒形成重组质。见图1-91所示。

(5)PCR测序结果  利用SP6和T7通用引物对克隆的3'端和5'端测序，经SeqMan拼接得到含有完整阅读框架(ORF)五指山猪SLA-DRB cDNA序列(见核苷酸比对中的WZSP-DRB1-348，已注册GeneBank，登录号为 DQ395123)。

(6)结果与分析

①五指山猪近交系群体DRB新等位基因编码序列的比较分析：利用DNAStar将所得的新等位基因与GeneBank中的其他等位基因进行比对分析，得到801个核苷酸残基，除末端终止密码子外，编码266个氨基酸残基。经分析第1～29位氨基酸为信号肽，第30～123位氨基酸为a1功能区；第124～217位氨基酸为a2功能区；第218～266位氨基酸为跨膜区和胞浆区。

②五指山猪近交系群体DRB新等位基因的进化关系：图1-92和图1-93显示具有完整阅读框的五指山猪新DRB等位基因与NIH小型猪DRB-c、DRB-d等位基因及中国人群高频等位基因HLA-DRB*120101、HLA-DRB*09012的核苷酸序列及其相应氨基酸序列比对。在核苷酸水平，该新等位基因与 NIH小型猪DRB-c和DRB-d的同源性为92％和93％，与人的HLA-DRB*120101、*09012基因的同源性为81％和83％，在氨基酸水平进行比较，发现与DRB-c和DRB-d同源性为分别为88.7％和91.4％，而与人的则为72.4％和74.8％之间。

③五指山猪近交系群体中新的DRB分子和人CD4T细胞结合部位的结构分析：参与T细胞对抗原识别和信号转导的相关分子有多种，其中包括辅助受体CD4。CD4分子属免疫球蛋白受体超家族，在细胞外具有4个IgV样结构域，表达于部分T细胞和胸腺细胞表面。CD4分子的生物学作用之一是作为细胞表面的一种辅助分子与MHCⅡ类分子的非多态性区域结合，有利于稳定T细胞受体(TCR)和 MHC之间的相互作用，并参与T细胞活化信号的转导。已确定DRβ链第134～148位氨基酸残基与人CD4分子结合。将五指山猪近交系群体新的DRβ链和HLA-DRB*DRB*09012、*120101、*1503、*030102、*040701等β链的CD4结合部位相比，发现五指山猪近交系DRB分子和HLA的这些分子与CD4分子结合的关键氨基酸残基序列完全相同(见图1-93的“*”标记)。

(三)讨论

早在100多年前，就有移植动物组织治疗人类器官衰竭患者的报道。经过多年研究，临床和基础移植学家公认，猪是异种移植物的最佳来源。以猪作为供体进行猪-人器官移植，是解决临床移植中器官短缺最有希望的途径之一，其中涉及一系列复杂的移植物排斥反应，主要包括超急性排斥(HAR)、延缓性异种排斥(DXR)和急性细胞性排斥(ACR)。获得表达人补体调节蛋白的转基因猪在克服HAR方面已有所突破之后，解决细胞性排斥反应被提上日程。细胞性排斥反应主要是由供体和受体的主要组织相容性复合体所编码的一类细胞表面转膜蛋白之间的不相容而引起的。在主要组织相容性复合体三类基因中，SLAⅡ类抗原主要针对外源抗原发挥免疫作用。故研究适合于异种器官移植的中国猪品种的 SIA免疫遗传学特性具有重要意义。

同一物种无亲缘关系个体带有不同的MHC等位基因，其编码的MHC分子是同种异体移植中T细胞识别的靶目标。其中有直接识别和间接识别之分，直接识别是受者的T细胞识别供者APC(抗原递呈细胞)的MHC分子或这些分子递呈的抗原肽；间接识别是受者的T细胞识别受者APC的MHC分子递呈的供者抗原肽。异种细胞性免疫的最大争论是，反应性T细胞能否无需经过抗原的加工和递呈直接识别异种MHC。已有的离体实验证实，人T细胞对小鼠异种抗原的识别主要采取间接识别方式。但是最近发现异种反应中人T细胞能直接识别猪的腹主动脉内皮细胞并证实CDST细胞能直接识别猪腹主动脉内皮细胞上的异种抗原，该机制相似于同种反应。谢晋等(2000)及沈佰华等(2001)利用人特异性T细胞系对猪白细胞抗原识别的研究发现，异种移植初期以直接识别为主导，随着移植物存活时间的延长逐渐转向以间接识别为主。在初期直接识别的过程中，CD4T细胞优先识别SLA-DR，其次是SLA-DQ。推测这种识别方式的不同源于人与猪的同源性高于与小鼠的同源性。陈福祥等(2002)对广西猪、贵州香猪和云南小耳猪 DRB基因序列与中国人中频率较高的HLA-DRB等位基因及小鼠H-2 DRB基因编码的氨基酸进行同源性比较，其分别为：73.0％～76.4％和70.2％～72.4％。本实验所获得的WZSP-DRB基因的氨基酸序列与人HLA-DRB基因的氨基酸序列比较，其同源性为72.4％和74.8％。均证实猪与人之间有更高的同源性。另外，吴群等将SLA-DRA和DRB基因的氨基酸序列与HLA相应氨基酸序列中与CD4分子结合的部分进行比较，发现SLA-DRA仅有2个参与结合所必需的关键氨基酸残基不同，即第125位精氨酸(Arg)变成甘氨酸(Gly)，第129位缬氨酸(Val)变成异亮氨酸(Ile)；而SLA-DRB参与结合所必需的关键氨基酸与人的完全相同，与本实验的结果一致。这种与CD4结合部位微小差异可能减少移植时的不相容性，及采用不同的识别方式(直接识别和间接识别)是否有关，则有待深入研究。

在人-猪异种移植中，人免疫细胞对靶细胞的识别或效应并非依赖于单一机制，而是多种复杂机制相互交叉，综合发挥作用。在移植排斥反应的不同阶段，参与反应的效应细胞类型和识别方式各异，从而对阐明异种移植排斥反应的机制造成困难，也使临床上对排斥反应的检测和防治增加了难度。本实验仅对SLA-DRB新等位基因进行了简单的比较分析。对异种器官移植排斥反应机理的阐明，还有待于各相关研究的进一步探索和对SLA各经典基因及其功能的彻底研究。