就理论上而言，在猪-人异种器官移植中，猪SLAⅠ类分子是引起急性细胞性排斥反应的核心因素，足以显示出SLAⅠ类分子重要性。为确证中国异种器官移植猪首选品种——WZSP近交系SLAⅠ类分子对中国人T细胞的抗原性，对其进行深入分析，需了解在WZSP近交系群体中，SLAⅠ等位基因数及其特征，以及与人的核苷酸和氨基酸变异点，为此开展了本研究。

(一)材料和方法

根据WZSP近交系群体的系谱分析，同世代每个家系选择8头、共32头。由中国农业科学院畜牧研究所试验猪场提供。按照分子遗传学常规方法进行了菌株和克隆载体选择、试剂和药品的溶液配置、RNA提取和检测、PCR引物的设计与合成、反转录-PCR反应(RT-PCR)、PCR产物的回收和克隆测序、序列的比对和相应氨基酸的推导及其分析等。

(二)结果与分析

1. SLAⅠ-1基因多态性检测

(1)SLAⅠ-1基因扩增结果  可获得约为607bp的特异性条带(图1-94)。

(2)SLA-1基因的克隆测序结果  回收纯化特异性片断，与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取克隆子进行随机测序，检测出在五指山猪近交系群体中SLAⅠ-1基因存在2个等位基因，结果用CLUSTALW(1.82)软件分析整理如图1-95所示。

2.SLA I-2基因多态性检测

(1)SLAⅠ-2 PCR结果  如图1-96所示。

(2)SLAⅠ-2基因的测序比对结果  如图1-97所示。

(3)SLAⅠ类基因品种内进化树分析结果  如图1-98所示。

在WZSP近交系群体中，SLAⅠ-1，SLAⅠ-2均发现2个等位基因，由于它们是异种旁系同源物的关系，本实验采用邻近聚类法(Neighbor-joining, NJ)研究了这三个基因的分子进化遗传分析。

3. SLAⅠ-3基因的多态性检测及结果分析

(1)SLAI-3基因的PCR扩增  首先进行了RNA的完整性检测和RT-PCR扩增产物克隆、菌落PCR扩增检测、特异性鉴定。WZSPcDNA中扩增出一条长度为566bp和565bp的条带。1.5％琼脂糖电泳检测，结果见图1-99所示。其菌落PCR扩增结果见图1-100所示。其质粒酶切鉴定见图1-101所示。

(2)PCR测序结果  根据WZSP近交系系谱和引物的扩增结果，每个家系选择2头个体进行测序，共测16个样。测序结果见图1-102所示。

(3)五指山猪近交系SLAⅠ-3等位基因

核苷酸序列分析用WZSP近交系32头个体分别进行了RT-PCR扩增，其产物包括SLAⅠ-3基因外显子1的3'端部分，外显子2和外显子3大部分序列。获得10个不同的等位基因核苷酸序列，这10个序列均为SLAⅠ-3位点的新等位基因，但这些等位基因间核苷酸变异很少，有的序列间仅有1～3个核苷酸差异，最多的也仅有47个核苷酸变异。其中，L3R3-384和L1R1-347仅有1个碱基突变，且为无义突变。而这些等位基因与GeneBank上其他相应的等位基因间则有很大的核苷酸变异。这9个新等位基因已注册CNKI，名称分别为：SLAⅠ-3*Wu01，SLAⅠ-3*Wu02，SLAⅠ-3*Wu03，SLAⅠ-3* Wu04，SLAⅠ-3*Wu05，SLAⅠ-3*Wu06，SLAⅠ-3*Wu07，SLAⅠ-3*Wu08，and SLAⅠ-3*Wu09，登录号分别为：DQ399654，DQ399655，DQ399656，DQ399657，DQ399658，DQ399659，DQ399660， DQ399661，and DQ397518。其核苷酸序列比对见图1-102。

(4)SLAⅠ-3等位基因的氨基酸序列分析  图1-103展现的氨基酸比对结果，发现2个半胱氨酸残基和N-连接糖原与人之间有高度保守性。SLAⅠ-3a1功能区氨基酸变异主要集中在50～85，与Parham等(1988)证实的HLAⅠ-Ⅰ类抗原分子结合槽的a螺旋部分一致。而氨基酸的另一高变区，即a2功能区的β-折叠和α-螺旋，则分别集中在氨基酸序列的98～119和146～172区域。HLAⅠ分子β-折叠上的98、100、102、117和119等五个氨基酸残基是加工处理过外来抗原的结合位点；SLAⅠ类分子中具有高度变异a-螺旋的158、159和170三个氨基酸残基，也位于HLAⅠ分子加工处理过外来抗原的识别位点。同时，与HLAⅠ类分子a2功能区CD8分子识别结合的序列比较，发现WZSP近交系9个新等位基因编码的氨基酸序列在105～118的105、112和118等三个关键氨基酸残基与人的完全相同，具有很好的保守性。

(5)SLAⅠ-3等位基因系统树的构建  为了研究WZSP近交系群体中这9个新SLAⅠ-3等位基因与其他猪品种和人相应等位基因间的遗传关系，利用邻接法构建其系统树，见图1-104所示(人的等位基因作为外群)。

WZSP近交系群体的等位基因除SLA-3*Wu05外，可以很容易和PD7genomic clone聚合在一个很小的基因簇内，且bootstrap值在60％以上，支持以上结论。另外，L1R1-384则单独成一个，既不和WZSP近交系其他等位基因聚合，也不和另外的等位基因聚合。通过MP构建系统树，除表现以上情况外，还可得出该等位基因与人有非常紧密的关系，但其bootstrap值仅为21，不能很好地支持上面结论。

(6)SLAⅠ类分子与HLAⅠ类分子中自然杀伤细胞(NK细胞)受体的配体序列比较  发现SLAⅠ类分子中缺乏与NK细胞受体结合的关键氨基酸残基序列，见表1-51所示(下划线为结合所必需的氨基酸残基)。

4.讨论

(1)关于WZSP SLAⅠ-3等位基因的分析  相对于人的HLAⅠ类等位基因数量，已经报道的SLAⅠ类等位基因数量非常有限。获得更多的SLAⅠ类位点新等位基因核苷酸序列将有很重要的意义。本实验设计了4对特异性引物序列，对WZSP实验用近交系群体中SLAⅠ-3等位基因的分布进行了检测。对其RT-PCR产物序列分析发现了9个新的SLAⅠ-3等位基因，扩充了SLAⅠ-3基因遗传资源。在本实验中，有4头个体只能扩增出一条目的片段。根据MHC的共显性特点，推测可能有两种情况，一是该个体为纯合子，二是存在用所设计的特异性引物不能扩增出来的新等位基因。但就所查资料来看，第二种可能性很小。目前只需采集那4头组织样，扩增全长cDNA序列及克隆测序证实这种可能性。由于时间的限制，没再做进一步的研究。同时，对其聚类分析，发现L1R1-384等位基因单独聚为一类，这种独特性是WZSP所特有的基因资源，还是由于测序结果有误所致，还有待进一步证实。

(2)关于WZSP实验用近交系SLAⅠ-3基因的编码氨基酸序列分析  本实验从WZSP SLAⅠ-3基因的编码a1、a2功能区的氨基酸序列与HLA A的氨基酸序列进行了简单的比较分析，可看出猪和人之间有很高的保守性。特别是WZSP 9个新等位基因编码的氨基酸序列在105、112、118等三个关键氨基酸残基与HLAⅠ类分子CD8 T细胞识别结合的序列完全相同，而猪的其他等位基因编码的氨基酸在112、118位点上却与人的有部分变异。这是否证实WZSP比其他猪品种更有利作为实验动物，还有待于对其他SLA基因的研究和比较。同时，有必要利用MEGA3和Adaptsite Package program两个软件，从自然选择角度分析猪和人在单一氨基酸位点正向和负向选择之间的差异，有待于以后进一步比较分析和完善。

(3)关于与人HLAⅠ类分子中NK细胞受体的配体序列比较分析  现在培育表达人类补体调节蛋白的转基因猪已告成功，超急性排斥反应(hyperacute rejection, HAR)理论上已被克服。因此，异种移植后的迟发性排斥发应(delayed xeno-rejection, DXR)成为人们研究的重点。DXR主要由移植后诱发的异种反应性抗体(xenoreactive natural antibody, XNA)介导内皮细胞活化和单核细胞介导ADCC效应所致，其效应机制除种属特异性的自然杀伤细胞(NK细胞)和/或单核细胞介导ADCC效应外，CD4和CD8 T细胞均可独立介导异种移植排斥反应。NK细胞专一性识别那些不表达MHCⅠ类分子的靶细胞。通过多种NK细胞表面受体(抑制性受体或活化性受体)识别自身的MHCⅠ类分子或MHC- Ag肽复合物，产生抑制性或活化性信号，抑制或活化NK细胞。本研究还将获得WZSP近交系SLA-3抗原分子的氨基酸序列和HLA-Ⅰ类分子中与NK细胞受体的配体序列进行比较，发现SLAⅠ类分子缺乏这些与NK细胞受体结合的关键氨基酸残基，这一现象可能有两种截然相反的生物学意义：由于 SLAⅠ类分子不能与抑制性受体结合，使猪移植物细胞易遭到受者(人)NK细胞的杀伤；也可能由于 SLAⅠ类分子不能与活化性受体结合，使猪移植物细胞可逃避某些NK细胞的杀伤。同时，比较SLA-3重链a1和a2功能区和人相应区域氨基酸序列，发现有许多相同的氨基酸残基。不同种属动物的MHC分子仅存在较小差异，可能提示猪-人异种移植的排斥反应中，直接识别机制占有一定的地位。另一方面，将其氨基酸序列与HLA-A氨基酸序列中与CD8分子结合的部分进行比较，发现WZSP近交系的9个等位基因编码的氨基酸序列中与参加结合所必需的关键氨基酸残基完全一致，这种保守性有可能降低移植时的不相容性，即SLAⅠ类分子本身作为外来抗原不被人T细胞间接识别。此外，就图1-104SLAⅠ-3位点等位基因系统树来看，WZSP近交系在SLAⅠ-3位点和其他猪种有明显的差异，拥有其独特的等位基因簇，证明了五指山猪是我国独特的一个遗传资源库。

五、结论

通过研究可得出以下结论：

(1)采用PCR-SSCP结合克隆测序技术，检测了五指山猪近交系群体中SLAⅡ-DQA、DQB、 DRA和DRB基因第2外显子的多态性。发现DQA有多态性，DQB无多态性，SLA-DRA基因第2外显子保守性很强，SLA-DRB两个等位基因间仅有88％的同源性。

(2)利用RT-PCR及克隆测序技术检测WZSP实验用近交系群体SLAⅠ-1、-2、-3基因第2及第3外显子的多态性，对SLAⅠ类基因进行了分子进化遗传分析。

(3)利用RT-PCR技术克隆了WZSP实验用近交系群体中发现的SLA-DRB新等位基因cDNA全长序列，约为810bp左右。将所测序列在NCBI上分析，得到801个核苷酸残基，除末端终止密码子外，编码266个氨基酸残基。

(4)对WZSP近交系SLAⅠ类基因与人HLAⅡ类基因NK细胞杀伤抑制受体结合区相应氨基酸进行比较分析，发现WZSP近交系9个新等位基因编码的氨基酸序列在105、112、118等三个关键氨基酸残基与HLA类分子CD8T细胞识别结合的序列完全相同，为WZSP实验用近交系—人异种移植免疫学研究提供了材料。

下一步应深入开展的工作：

(1)根据实验所用WZSP的耳号，将SLAⅠ-1、2、3和SLAⅡ-DQA、DQB、DRA、DRB等7个基因位点进行整理，确定及标记WZSP实验用近交系群体中白细胞抗原单倍型，根据这7个基因位点在单倍型中的分布特性，设计PCR-SSP(序列特异性引物)对该近交系群体进行单倍型的检测和分型。可为SPF级特异单倍型猪的培育提供可靠的分析依据。

(2)选择WZSP实验用近交系群体所特有的等位基因进行SLA分子全长的原核表达，纯化体系，建立间接识别猪移植抗原SLA分子的人T细胞系，为寻找引起间接排斥反应的T细胞表位这一连续决定簇的分析打下基础和进一步的基因改造提供可靠的理论依据。