高血糖引起的糖尿病性视网膜病变斑马鱼筛选模型的开发：动物模型的可再现性验证

摘要：这项研究旨在建立糖尿病性视网膜病变的斑马鱼筛选模型，并评估了阿柏西普治疗糖尿病性视网膜病的疗效。在160 mM葡萄糖浓度下发生形态学改变。存活率和孵化率呈剂量依赖性下降。在130mM葡萄糖组，视网膜血管直径是正常组的两倍以上。在200μg/mL和400μg/mL阿柏西普浓度下，斑马鱼胚胎形态发生变化。在400μg/mL阿柏西普时，存活率和孵化率下降。100μg/ mL阿柏西普是斑马鱼糖尿病视网膜病变模型的无毒有效剂量。糖尿病视网膜病变炎症标志物在高血糖时表达增加。但是阿柏西普改善了斑马鱼眼的炎症反应。在糖尿病性视网膜病斑马鱼模型中，阿柏西普治疗后发现视网膜血管直径减小，证实了其分子生物学和组织病理学功效。 该模型可用于筛选治疗糖尿病性视网膜病的新候选药物。

关键词：糖尿病性视网膜病变  眼  炎症  斑马鱼

简介：糖尿病会导致许多人类疾病，例如糖尿病性视网膜病变（DR），由长时间暴露于高浓度葡萄糖引起的。糖尿病主要有两种类型，1型和2型。1型由胰腺不能产生足够的胰岛素引起，2型由胰岛素抵抗引起。DR引起视网膜血管损伤，引起视网膜组织肿胀，导致视力模糊。VEGF蛋白可控制糖尿病患者的病理性血管生成并增加血管通透性。炎症反应在DR的发生和发展中也起着重要作用。 DR中白介素6（IL-6）是升高的关键促炎细胞因子之一。IL-6家族细胞因子刺激斑马鱼视网膜神经节细胞JAK/STAT3信号转导。此外，高血糖会激活视网膜色素上皮细胞中的STAT3信号传导，并通过高葡萄糖浓度激活STAT3引起视网膜血管渗漏。DR中血管内皮细胞的生长也引起视网膜神经细胞的凋亡。高血糖会激活晚期糖基化终产物（AGE）/受体AGE（RAGE）途径。AGEs参与视网膜周细胞凋亡。该过程导致氧化应激和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）活化。 AGEs和促炎细胞因子（例如IL-1β和IL-6）均可增加VEGF mRNA的表达。在以前的报道中，糖尿病视网膜中的炎性细胞因子（如TNF-α和VEGF）通过减少紧密连接蛋白（ZO-1）来改变血管通透性。血视网膜屏障（BRB）是由视网膜内部的内皮细胞构成的。内皮细胞由紧密连接蛋白组成的单层。高葡萄糖可减少视网膜内皮细胞中ZO-1蛋白的含量和紧密连接的屏障功能。不仅如此，IL-1β诱导BRB内皮细胞形态和功能的改变。这表明DR与BRB的炎症和改变有关。

斑马鱼的视网膜在形态和生理上也与人类视网膜相似。特别是斑马鱼的视网膜结构有五层。斑马鱼也有类似的恒温机制来控制葡萄糖浓度。近年来，斑马鱼被广泛用作视网膜疾病的动物模型。这意味着斑马鱼是一种有用的人类眼部疾病模型。 斑马鱼的解剖结构与人类的解剖结构高度相关，可以评估其平行毒性。斑马鱼的肝脏、肾脏和血脑屏障与人体器官相似。斑马鱼已被用于新候选药物的早期筛选。新疗法的开发应在体内进行测试，以查看该化合物是否值得开发。此外，斑马鱼胚胎体积小，可以在小空间（如微孔板）进行实验，可以用最少的材料进行低成本筛选。斑马鱼DR模型是通过各种方法建立的。最简单的方法是用高糖溶液孵育斑马鱼。然而，有待进一步研究斑马鱼的形态变化、存活率和孵化率。它与糖尿病环境下的胚胎毒性试验相关。此外，阿柏西普已经被用来治疗DR，但其对斑马鱼的疗效尚未得到证实。本实验采用不同浓度的葡萄糖，通过测定胚胎毒性和视网膜血管厚度来观察葡萄糖的适宜浓度。然后，使用阿柏西普研究了斑马鱼DR模型的分子生物学和形态学变化。

不同葡萄糖浓度对斑马鱼胚胎形态的影响：斑马鱼胚胎的葡萄糖暴露会导致糖尿病甚至死亡。 如图1A和表2所示，最高的BT发生率是160 mM。 同时还发现了YSE和PE。150 mM和160 mM葡萄糖浓度组中，96 h的生存率最低，分别为63％和60％。150 mM和160 mM葡萄糖浓度组的孵化率分别为35%和40.8%。160 mM葡萄糖引起的形态学改变最多。存活率和孵化率随剂量和时间的增加而降低。

图1、FET法研究葡萄糖对斑马鱼胚胎发育的影响。（A）用葡萄糖（90、130、150和160 mM）处理24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎的代表性数据。 在每个时间点计算（B）存活率和（C）孵化率。

表2.葡萄糖浓度引起的形态异常发生率。CPFE：受精卵塌陷现象； YSE：卵黄囊水肿； PE：心包水肿； BT：尾巴弯曲； HE：头水肿。

葡萄糖和血管变化对斑马鱼幼虫的影响：视网膜血管直径的测量是DR早期诊断的重要组成部分。为了描述视网膜血管直径的变化，斑马鱼幼虫在短时间内暴露于高浓度葡萄糖中。如图2所示，幼虫的存活率随浓度的增加而降低。与正常组相比，视网膜血管直径呈剂量依赖性增加。此外，还对斑马鱼眼睛中葡萄糖浓度的影响进行了定量分析。葡萄糖浓度呈剂量依赖性增加。因此，证实在130mM浓度处对斑马鱼DR模型产生低毒性。

图2.葡萄糖对斑马鱼幼虫的影响。 （A）葡萄糖对斑马鱼幼虫的剂量依赖性影响，暴露于90、130、150和160 mM葡萄糖（3 dpf至6 dpf）。（B）显示了计数和测量视盘（黄色星号），分支点（红色圆圈）和血管直径（黄色线）的方法。在三个随机选择的位置测量视网膜血管直径。（C）荧光显微镜下6 dpf时斑马鱼Tg（flk：EGFP）的视网膜血管形态的平均直径和荧光图像。（D）分析斑马鱼眼中的葡萄糖浓度。

阿柏西普对斑马鱼胚胎的毒性：为了鉴定阿柏西普在斑马鱼DR模型中的作用，将胚胎暴露于50、100、200和400μg/ mL的阿柏西普进行毒性测试。由于尚未在斑马鱼中确定适合阿柏西普作用的浓度，因此在先前的研究中通过筛选确定了选定的浓度。如图3和表3所示，200μg/ mL时PE发生了形态变化。400μg/ mL时，YSE和CPFE发生了形态变化。200μg/mL和400μg/mL的存活率分别为95.4%和91.7%。在96 h时，200μg/ mL和400μg/ mL的孵化率分别为93.3％和85.8％。得出结论：200μg/ mL和400μg/ mL的阿柏西普对胚胎有影响。

图3、阿柏西普暴露对斑马鱼胚胎的影响。（A）暴露于阿柏西普（50、100、200和400μg/ mL）24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎的代表性图像。（B）存活率 （C）在每个时间点计算孵化率。CPFE：受精卵崩塌现象； YSE：卵黄囊水肿； BT：尾巴弯曲； HE：头部水肿。

表3、阿柏西普浓度引起的形态学异常发生率。

阿柏西普对斑马鱼视网膜血管的影响：显示了在高血糖环境中观察阿柏西普视网膜血管变化的结果。如图4A所示，斑马鱼幼虫在200和400μg/ mL的阿柏西普中死亡。 阿柏西普组视网膜血管直径减小。特别是100和200μg/mL组视网膜血管直径较葡萄糖组明显减小。结果表明，阿柏西普能在不引起毒性的情况下有效地减小斑马鱼血管直径，其有效浓度为100μg/mL。

图4.阿柏西普对视网膜血管和斑马鱼幼虫存活的影响。

斑马鱼糖尿病视网膜病变模型的可靠性研究：测量了斑马鱼视网膜血管的平均直径。在130mM葡萄糖组，视网膜血管直径相对于正常组增加。100μg/mL的阿柏西普组较葡萄糖组降低。计算ROC曲线。如图5C所示，敏感性和特异性为0.957和0.979。 视网膜血管直径的ROC曲线下面积（AUC）为0.992。斑马鱼DR证实了可靠的模型。

图5、斑马鱼视网膜血管平均直径

促炎细胞因子mRNA表达在斑马鱼糖尿病视网膜病变模型中的作用：与正常组相比，在130mM葡萄糖下，VEGF、IL-6、STAT3、IL-1β和TNF-α的mRNA的表达增加。而100μg/mL阿柏西普组与葡萄糖组相比，VEGF、IL-6、STAT3、IL-1β、TNF-α的mRNA表达均降低。果表明，在斑马鱼DR模型中，阿柏西普抑制了促炎细胞因子。

图6、高糖和阿柏西普对斑马鱼DR模型mRNA表达水平的影响。

斑马鱼糖尿病视网膜病变模型的组织学：观察了斑马鱼视网膜层的形态学变化。如图7A和D所示，各组的视网膜厚度均无变化。在葡萄糖浓度为130mM时，TUNEL阳性细胞出现在INL处，斑马鱼视网膜层出现明显改变。如图7A和D所示，各组的视网膜厚度均无变化。相比之下，暴露于100μg/mL阿柏西普的斑马鱼组的视网膜的影响降低。斑马鱼视网膜组织是用绿色荧光显微镜捕获的，没有染色，因为斑马鱼Tg（flk：EGFP + / +）在其血管中具有绿色荧光。

图7、斑马鱼糖尿病视网膜病变模型视网膜典型组织学研究。

通过IF染色判断GFAP和VEGF阳性细胞在ONL中表达。然而，与130 mM葡萄糖组相比，100μg/ mL阿柏西普组有所降低。与正常组相比，130mM葡萄糖组ZO-1表达降低。而100μg/mL阿柏西普组INL和ONL荧光表达增强。

图8、斑马鱼糖尿病视网膜病变模型视网膜的典型组织学改变（GFAP、VEGF和ZO-1）。

因此，斑马鱼DR模型的可靠性得到了验证。基于这些结果，斑马鱼模型可以筛选、比较和分析预防DR的新药的变化。此外，分子、生物学和组织学研究发现，在阿柏西普治疗组中与DR相关的炎症因子减少。斑马鱼可以用来快速评估药物的早期毒性和疗效。利用斑马鱼胚胎发育阶段进行毒性评估是有效的，因为它不受法律制裁。作为与人类有密切联系的动物模型，斑马鱼的实验结果可以进行高效的毒性评价。因此，它们有助于确定疾病的影响和机制。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332220313949