斑马鱼模型：炎症和药物发现

斑马鱼是一种小型硬骨鱼，在药理和毒理学的许多领域中都使用过。 这种动物模型对于发现抗炎药具有优势，例如具有实时评估细胞迁移机制的潜力。斑马鱼体内的炎症细胞、介质和受体与包括人类在内的哺乳动物相似。无论是幼虫还是成年斑马鱼的炎症疾病模型都是筛选新的抗炎化合物的一个很有前途的工具，有助于我们理解慢性炎症疾病的机制。在这篇综述中，我们概述了斑马鱼中炎症反应的特征，强调了它与该研究领域中药物发现的相关性。

简介：慢性炎症包括失调和适应不良反应，包括持续的炎症、组织破坏和组织修复失败，持续数周到数年。急性炎症的机制是明确的。然而，慢性炎症的确切过程仍然未知。人类疾病，如哮喘、过敏、动脉粥样硬化、癌症、关节炎和自身免疫性疾病，都是无法治愈的慢性炎症的例子。这类疾病是当前全球研究和开发的重点，旨在发现具有更高疗效和更少不良反应的新型抗炎药。经过验证的炎症临床前实验模型对于进一步了解慢性炎症性疾病，从其病理生理学到创新的治疗方案至关重要。斑马鱼是一种小型硬骨鱼，在过去的几十年里，它在炎症研究中受到了关注。体内模型比体外模型具有额外的转化有效性，说明斑马鱼在炎症研究中的应用。斑马鱼作为动物模型用于研究炎症的过程始于2000年代，从2011年开始，出版物数量大量增加。对Scopus数据库进行搜索出现了1441个结果，在2019年发表了大量的文章。鉴于炎症参与许多慢性疾病中，斑马鱼的临床前炎症疾病模型与该领域的进展有关。在这篇综述中，我们讨论了斑马鱼的炎症反应，以及以斑马鱼作为炎症模型的主要研究。还重点介绍了使用斑马鱼作为实验生物的药理方法。

斑马鱼的炎症细胞：斑马鱼的造血系统类似于其他脊椎动物，具有多个细胞分化阶段。造血干细胞（HSCs）起源于背主动脉腹壁的造血内皮细胞，这些HSCs的一个亚群迁移到尾部造血组织（CHT），在那里产生多种细胞谱系。在胸腺中，造血干细胞产生T淋巴细胞，而在肾脏中，造血干细胞产生红系、髓系和B淋巴细胞。但是，斑马鱼的适应性免疫系统要等到鱼从幼虫发育到成年阶段才能充分发挥功能。 首批B细胞仅在受精后20-21天（dpf）出现。斑马鱼幼虫的透明性可以实时观察炎性细胞的迁移。因此，使用20 dpf的斑马鱼幼虫是评估先天免疫反应的一个有价值的工具，这是斑马鱼优于啮齿动物模型的一个优势。

切断斑马鱼尾巴诱发的炎症，中性粒细胞发出绿色荧光

对于微生物感染，炎症反应由识别分子触发，如Toll样受体（TLRs）和核苷酸结合寡聚结构域（NOD）样受体。目前，靶向TLR和NOD信号的药物是治疗慢性炎症的有吸引力的替代品。TLR基因已经在斑马鱼中得到了表征，其中一组核心的直系同源基因与人类TLR高度保守。 总体而言，斑马鱼已鉴定出14种不同的TLR类型。还对NOD样受体进行了表征，其中有五个与人类直系同源的截然不同的成员。但是，即使直系同源受体在人类和斑马鱼中也可能具有不同的功能。 因此，仍然需要对斑马鱼中微生物识别受体的特定功能进行深入研究，以进一步了解它们在与哺乳动物有关的硬骨鱼中的作用。在检测到感染后，炎症细胞被募集，驱动各种炎症介质的产生。 斑马鱼中募集的主要白细胞是嗜中性白细胞，数量最多，是最早到达受伤部位的细胞。另外，中性粒细胞的凋亡对炎症的解决具有重要作用，可以作为治疗慢性炎症性疾病的一种策略，可在斑马鱼中进行筛选。斑马鱼体内存在巨噬细胞，有助于控制炎症，参与器官发生、组织再生和重塑。斑马鱼巨噬细胞亚型的鉴定突出了这些细胞从鱼类到哺乳动物的进化保守性。

肥大细胞是一个前哨细胞，能抵抗感染，它们协调促炎和抗炎反应之间的平衡，释放激活效应中性粒细胞的介质。肥大细胞在斑马鱼的鳃和肠中被鉴定出，显示出与哺乳动物细胞在结构和功能上的相似性。嗜酸性粒细胞是粒细胞白细胞，在对蠕虫抗原和过敏原的应答中具有保守作用。 在斑马鱼中，嗜酸性粒细胞表现出过氧化物酶活性，对髓过氧化物酶呈阴性，而没有分叶核。或者，哺乳动物嗜酸性粒细胞在成熟过程中经历核分裂。然而，斑马鱼可以作为一个很好的模型来评估这些细胞在慢性炎症中的作用，因为它们在进化过程中相对保守。此外，针对嗜酸性粒细胞的抗过敏治疗是一种很有希望的策略，可以抑制一系列未满足的医疗条件下的过度炎症，例如哮喘和特应性皮炎，斑马鱼可以作为筛选模型。

血小板在血栓形成和伤口修复中的作用众所周知，但它们招募其他免疫细胞，在炎症中起着关键作用。斑马鱼血液中含有成熟的红细胞和血小板，它们是有核的，不同于人血小板。然而，血小板的特征表明斑马鱼血小板同的哺乳动物血小板同源。因此，借助染色技术和遗传工具，斑马鱼成为评估炎症条件下血小板功能的合适模型。

斑马鱼体内有两种淋巴细胞：B细胞和T细胞。B细胞的发育是动态的，在发育过程中会发生变化；此外，与其他硬骨鱼类相比，B细胞的吞噬活性较低。硬骨鱼中已鉴定了一些T淋巴细胞亚群，但缺乏针对斑马鱼CD4 +和CD8α+ T细胞的选择性单克隆抗体（mAb），阻碍了这一领域的进一步发展。

免疫系统的细胞在炎症反应中起关键作用。 其组织分布和表型完全改变了炎症结果。尽管对斑马鱼的免疫细胞没有完整的描述，硬骨鱼的主要效应细胞具有特征性，表现出与啮齿动物和人类在形态和造血方面的相似性。尽管仍需要进一步的研究，但可以使用斑马鱼进行具有炎症性的研究，具有相关的转化价值。在这种情况下，针对斑马鱼中性粒细胞迁移的研究揭示了细胞迁移机制的新证据。 此外，成像工具的进步和基因编辑技术的应用为使用斑马鱼作为炎症动物模型的体内研究提供了有趣的平台。

斑马鱼中不同血液细胞的形态学。

斑马鱼炎症的介导子和效应子：炎性反应由血浆，炎性细胞和/或受损组织衍生的多种化学介质调节。 一般来说，这些介质可根据其生化特性分为七类：（i） 血管活性胺；（ii）血管活性肽；（iii）补体成分；（iv）脂质介质；（v）细胞因子；（vi）趋化因子；（vii）蛋白水解酶。斑马鱼是一种动物模型，具有发现涉及炎症介质（包括炎症小体激活）的机制的潜力。

血管活性胺：肥大细胞，嗜碱性粒细胞和血小板的许多生物学效应是由从细胞质颗粒释放的生物胺介导的，这些胺继而作用于血管和平滑肌，从而导致血管通透性增加，血管舒张或血管收缩，具体取决于环境。这类介质的成员包括组胺和血清素（5-HT），它们通过与靶细胞上不同受体结合而起作用。鉴于5-HT受体广泛表达，很难将独特的受体与炎症联系起来。5-HT通过诱导趋化和细胞因子分泌发挥其免疫调节作用。在斑马鱼中鉴定出该家族的两个受体5-HT1和5-HT2。其他5-HT受体（例如5-HT4和5-HT7）在哺乳动物的炎症中也起着重要作用，但在斑马鱼中的作用尚未得到鉴定。 最近的证据表明5-HT在外周免疫系统中发挥重要作用。哺乳动物的一系列研究表明，血小板，肥大细胞，抗原呈递细胞和T细胞可能会合成，转运，储存和/或响应5-HT。据我们所知，还没有关于和/或鉴定斑马鱼免疫细胞中5-HT及其受体的研究。然而，5-HT在免疫细胞调节中的作用已在另一硬骨鱼模型中报道。此外，在斑马鱼尾鳍再生过程中还发现了5-HT免疫反应阳性的副神经元细胞。这表明5-HT在斑马鱼炎症中的相关性，为硬骨鱼在临床前炎症研究中的应用开辟了新的可能性。组胺介导与神经炎症和神经退行性疾病有关的生理和病理过程。组胺通过激活四种G蛋白偶联受体诱导免疫调节作用，H1是过敏反应的主要亚型。在斑马鱼中，H1，H2和H3受体由不同的细胞表达，但组胺在斑马鱼的外周组织中不表达。 相比之下，大脑中的组胺浓度与其他脊椎动物处于同一范围内。斑马鱼的这一特征对于探索组胺在大脑中的作用以及药物在这个系统中的作用特别有用，而不受任何外周机制的影响。然而，Hrh4是一种很有前途的抗炎药受体，但在斑马鱼中似乎没有同源基因，该模型有一定的局限性。人类中H1和H4受体之间重叠的功能可能仅由斑马鱼中的H1受体执行。因此，在这种动物模型中对抗H1受体策略的评估可以对其提供治疗和神经毒理学作用的初步见解。

血管活性肽：血管活性肽是一类在各种组织中起作用的激素，特别是对血管平滑肌细胞。这一类包括血管收缩剂、血管扩张剂和具有混合作用的肽。P物质是从感觉神经元释放出来的，它本身可以引起肥大细胞脱颗粒；在斑马鱼中，它由tac1编码。可通过蛋白水解处理细胞外液中非活性前体（例如纤维蛋白降解产物）产生血管活性肽。在发炎的情况下，痛觉通过提醒机体损伤组织的异常状态，起着重要的生理作用。在这种情况下，缓激肽影响血管系统，并具有强大的镇痛作用。斑马鱼具有与哺乳动物相似的血管活性肽，是检测纤维蛋白/纤维蛋白原抑制剂和缓激肽受体拮抗剂的良好动物模型。

补体成分：补体系统介导几个主要的效应器功能和调节适应性免疫反应。哺乳动物补体系统和信号通路的许多组成部分在斑马鱼中高度保守。哺乳动物过敏毒素C3a、C4a和C5a在炎症反应中表现出相关的作用。它们促进粒细胞和单核细胞的募集，诱导肥大细胞脱颗粒，从而影响血管系统。在斑马鱼心脏再生早期，补体受体C5aR1和C3aR1高度上调。据报道，与哺乳动物不同，斑马鱼基因组中存在八个编码C3的基因，它们在不同的组织中表达，而哺乳动物中的补体因子主要在肝脏中分泌。对内毒素诱导表达的研究也揭示了不同器官中C3的差异调节。然而，鲜有人知斑马鱼中过敏毒素的作用。 因此，需要进一步研究探索补体成员及其在斑马鱼中的生理作用。

脂质介质：脂质介体源自磷脂，可在细胞膜发生损伤时释放，从而通过磷脂酶A2从磷脂产生花生四烯酸。随后，通过脂氧合酶和环氧合酶的作用，产生白三烯、血栓素和前列腺素，引起血管扩张、痛觉过敏和发热。前列腺素E2（PGE2）通过激活其受体EP4，随后刺激15-脂氧合酶和脂素A4的释放，来解决由创伤引起的斑马鱼炎症。后一种途径是脂质分解机制的一部分，包括从炎症部位清除中性粒细胞。大多数脂质介质是由斑马鱼细胞产生的，广泛参与了硬骨鱼的炎症变化。

细胞因子：细胞因子是炎症的关键调节因子，通过复杂的信号通路发挥作用，参与急性和慢性炎症。它们的作用可以是自分泌、旁分泌或内分泌，它们在细胞通讯中的作用超越了免疫系统。白介素与特定的膜受体结合，在细胞间通讯中起着关键作用。肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）是由免疫细胞产生的一种多功能细胞因子，在感染过程中诱导炎症反应，参与多种细胞活动，如细胞存活、增殖和分化。干扰素（IFN）除了具有抗肿瘤作用外，还对病原体（主要是病毒）产生反应。集落刺激因子（CSF）对造血细胞的分化和增殖具有重要作用。最后，转化生长因子（tgf）主要参与细胞增殖。斑马鱼细胞因子的鉴定和表征揭示了与哺乳动物相似的功能和结构，支持斑马鱼炎症模型的应用。斑马鱼可能有助于细胞因子分子的初步筛选和测试这些化合物的潜在疗效或毒性。

趋化因子：趋化因子是免疫细胞迁移所必需的一类炎症介质，在炎症和正常生理条件下都起作用。CXC、CC、C和CX3C趋化因子。斑马鱼共鉴定出33种趋化因子受体和89种趋化因子基因。然而，仅对Cxcl12a、Cxcl12b、Ccl19和Cxcl8（Il8）进行了功能表征，在哺乳动物中存在保守的对应物。这些炎症介质的重要性为使用斑马鱼作为生物模型测试基于趋化因子的治疗策略提供了可能性。

蛋白水解酶：此处讨论的最后一个炎症介质是蛋白水解酶，也称为肽酶，蛋白酶或蛋白酶，它们能破坏蛋白质氨基酸之间肽键。在宿主防御、组织重塑和白细胞迁移等过程中发挥重要作用。由于其固有的生物活性，这组酶有多种生物技术应用。根据基本催化成分蛋白酶可分为四类：（i）半胱氨酸蛋白酶；（ii）丝氨酸蛋白酶；（iii）天冬氨酸蛋白酶；和（iv）金属蛋白酶。组织蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，导致组织损伤，引发慢性炎症，是一种很有吸引力的治疗策略。丝氨酸蛋白酶也参与促炎细胞因子的产生，从而激活免疫细胞。一些疾病与这些酶的失调有关，包括皮肤和肺部炎症、神经炎症和关节炎。在斑马鱼中克隆了胰蛋白酶基因，并证明了与其他脊椎动物的同源性。斑马鱼中存在四个蛋白酶激活受体（PARs）基因，它们是哺乳动物PAR1-3的同源物。 斑马鱼PAR-1是凝血酶受体，PAR-2b是胰蛋白酶受体。凝血酶在止血中起着关键作用，由凝血酶原产生，斑马鱼与人类的氨基酸同源性为53%。

斑马鱼炎症模型：考虑到与人类共享相似性的细胞和分子途径，令人信服的证据表明斑马鱼对炎症研究的重要性。因此，在过去的几年里，利用斑马鱼建立了几种炎症模型。斑马鱼的一个优点是可以选择使用这种硬骨鱼的幼虫和/或成体阶段。如啮齿动物，斑马鱼炎症可由物理、化学或生物刺激引起。在幼虫阶段，通常是通过截尾鳍来造成伤害。 通常可以在受精后72小时使用24号针头进行切割，或者使用低温恒温器进行更精确的切割。手术必须在无菌条件下进行。用于诱导斑马鱼发炎的其他物理刺激包括紫外线照射和电消融。这两种模型都能诱导大量的炎症反应，对于斑马鱼幼虫炎症的临床前分析非常有价值。在成年斑马鱼（∼6月龄）中，也采用了类似的物理损伤方案。尽管斑马鱼炎症的物理损伤模型具有广泛的适用性，但是这些方法是固定的，需要单独的操作和特殊的设备，从而阻止了它们在大规模筛选方案中的使用。此外，身体伤害会影响一些行为任务的评估。因此，验证一系列化学斑马鱼炎症模型。根据斑马鱼幼虫阶段的评价，D’Alençon提出了一种硫酸铜诱导的化学性炎症模型，在20min内诱导白细胞向神经胶质细胞浸润。鉴于病原体引起的炎症性疾病的数量和种类，斑马鱼感染相关炎症的具体方案已用于临床前分析。在大多数情况下，炎症是由脂多糖（LPS）引起的。开发模拟斑马鱼慢性炎症的方法非常重要，因为大多数慢性炎症性疾病仍缺乏有效的药理疗法。

抗炎药对斑马鱼炎症的影响：斑马鱼炎症模型对传统的类固醇和非甾体抗炎药（NSAIDs）治疗有反应，强调了这种生物在炎症研究中的适用性。例如，在成年斑马鱼的慢性酒精摄入模型中，非甾体抗炎药甲芬那酸能够通过调节乙酰胆碱酯酶的脑活动来预防认知障碍，证实了甲芬那酸对神经炎症的作用。另一种非甾体抗炎药吲哚美辛在戊四氮诱导的斑马鱼幼鱼癫痫模型中表现出神经保护作用，可能是通过调节促炎基因il1b和cox2b引起的。非甾体抗炎药（如阿司匹林）的益处在斑马鱼幼虫醋酸暴露诱导的伤害性模型中得到了证实。在成年斑马鱼剪尾鳍引起的疼痛样行为模型中阿司匹林也显示出镇痛作用。用非甾体类药物吲哚美辛或双氯芬酸钠预处理，可分别改善福尔马林或醋酸对成年斑马鱼的伤害行为。最近，开发一种称为“鱼类行为指数”的自动化方法，用于检测成年斑马鱼在机械或化学伤害性刺激后的一般活动和游泳距离的伤害性变化。在这类实验中，非甾体抗炎药氟尼新对剪断尾鳍的斑马鱼表现出剂量相关的镇痛作用。这些证据表明，斑马鱼也可以作为评估新的潜在镇痛药物的可靠模型。

结论和展望：斑马鱼呈现出具有哺乳动物特征的复杂免疫系统。通过表征实时中性粒细胞迁移模式，斑马鱼还被证明可用于研究解决机制，主要是通过实时嗜中性粒细胞迁移模式的表征。通过斑马鱼的炎症性疾病模型可以增进我们对与慢性炎症性疾病有关的复杂机制的了解，为鉴定有效和安全的药理策略开辟新途径，以治疗与炎症相关的未满足的临床需求。已经建立斑马鱼的急性炎症模型，但是其他慢性炎症模型还需要进一步的验证。还需要进一步研究斑马鱼炎症介质和受体的特性。此外，选择性抗体的开发能够在蛋白质水平上深入表征斑马鱼的炎症反应。 最后，可以通过TALENS和CRISPR-Cas9等新的遗传工具，产生新的斑马鱼突变株，可用来评估生物制剂的效果。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359644620303962#bib0135