肠道是人体重要的消化吸收的场所，也是最大的免疫器官。肠道微生物组、免疫细胞和粘膜屏障共同筑成了肠道上皮的稳态，是人体健康的重要防线之一。这里和大家一起精读一篇发表在Journal of Experimental Medicine杂志上的文献，该研究首次揭示了通过小肠上皮细胞（IEC）来调节T细胞分化（IEL，上皮内淋巴细胞）的分子机制，此外，研究发现微生物群对于小肠中MHCII和PD-L1以及IEL的上皮分化至关重要。

小肠中，经典CD4+ T细胞可分化为CD4+ CD8αα+上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes, IELs），但是它们周围的小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）在其中的作用还不明确。近日，Dr. Moon带领的韩国团队研究发现：在小肠远端，IECs在微生物群和IFN-γ的刺激下能通过表达MHC II类分子和程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1），提供生态龛（niche）适应信号，来促进CD4+CD8αα+IELs（DP IELs）的分化。 这一研究结果发表在了Journal of Experimental Medicine杂志上[1]。

备注：下文中的SP表示CD4+单阳性（single positive）细胞；DP表示CD4+CD8+ 双阳性（double positive）细胞。

IELs的分化需要IECs上MHC II的表达

为了探究IECs在DP IELs分化过程中起到了非典型APC的作用，研究者们分析了C57BL/6野生型小鼠小肠不同部位中，MHC II在IECs上的表达情况。一系列的流式实验、RNA-seq实验都显示IECs在DP IELs分化过程中的作用与MHC II抗原呈递相关。此外，为了弄清楚IECs表达的MHC II在DP IELs分化中的作用，研究者们使用了一种特异性在IECs中敲除了MHC II的小鼠（MHC II△IEC），并通过与MHC IIfl/fl对照组小鼠相比，证实了IELs的分化需要IECs上MHC II的表达（图1G-H）。

图1G-H. 流式（G）和免疫荧光实验（H）都显示：与MHC IIfl/fl对照组小鼠相比，MHC II△IEC小鼠的DP IELs在SP IELs细胞中的比例显著下降。此外，免疫荧光实验（H）显示，大部分DP IELs都与高表达MHC II的上皮细胞的基底外侧面相接触。

MHC II在IECs上的表达依赖于IFN-γ的存在

有报道显示IFN-γ在非造血细胞（例如IECs）中能强效诱导MHC II的表达。为了进一步验证这个结论，研究者们使用了一款IFN-γ受体敲除小鼠（IFN-γR−/−）。与前人的实验结论一致：在IFN-γR−/−小鼠的IECs上，未检测到MHC II的表达，而且DP IELs分化严重受阻，其在SP T细胞中的比例几乎为0（图2A）；在野生型小鼠中，加入anti-IFN-γ抗体后，MHC II的表达水平以及DP在SP IELs细胞中的比例都显著降低（图2B）。此外，有报道显示IFN-γ是DP IELs分化所必需的：它能通过诱导转录因子T-bet的表达，促进DP IELs的分化。这说明IFN-γ在DP IELs的功能成熟中起到了重要作用。

图2A-B. IFN-γ在非造血细胞（例如IECs）中能强效诱导MHC II的表达。 

为了探究IELs和IECs中，IFN-γ对DP IELs分化的影响，研究者们构建了骨髓（Bone marrow，BM）嵌合体小鼠：从供体小鼠的腿骨中取得BM细胞，静脉注射到经致死剂量辐照后的受体小鼠体内（供体小鼠的造血细胞→受体小鼠），8周造血重建期过后处死受体小鼠。结果显示（图2C）：无论是在造血细胞（例如CD4+IELs），还是非造血细胞（例如IECs）中，DP IELs的分化都需要完整的IFN-γR信号。此外，之前在野生型小鼠中观察到的不同小肠部位中MHC II表达量和DP IELs比例的明显差异，在BM嵌合型小鼠中都未能观测到。研究者们推测这有可能是因为免疫重建后的受体小鼠比稳态时产生了更多的IFN-γ，而这改变了肠道微环境，使其炎症化，因此消除了这种区域性差异。

图2C. DP IELs的分化需要完整的IFN-γR信号。

为了直接探究MHC II+IECs是否在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，研究者们构建了分别来源于IFN-γR+/+小鼠和IFN-γR−/−小鼠的小肠类器官（orgnoids）。他们首先验证了IFN-γ在类器官中能发挥与体内一致的效果：IFN-γ能强效诱导类器官中IECs上MHC II的表达（图2D-E）。此外，有研究显示，T-box expressed in T cells （T-bet）是DP IELs分化过程中的重要上游调控因子，它能诱导Runx3的表达并抑制ThPOK 的表达；而T-bet诱导产生的细胞因子（例如IFN-γ）在肠道微环境刺激因子的存在下，能进一步促进DP IELs的分化。因此，研究者们在肠道微环境刺激因子TGF-β和视黄酸（Retinoic acid,RA）存在的情况下，将经IFN-γ和卵清白蛋白多肽（ovalbumin peptide，OVAp）预刺激后的小肠类器官，以及经anti-CD3ε/CD28预刺激后的OVA特异性CD4+ T细胞（OT-II）进行24h共培养（图2F）。结果显示：IFN-γ能诱导MHC II大量表达；MHC II+IECs在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，且TGF-β和RA刺激能进一步促进DP IELs的分化。

图2D-E. 流式（D）和免疫荧光实验（E）显示：进行IFN-γ刺激后，IFN-γR+/+小鼠来源的类器官IECs上的MHC II表达水平显著升高，而IFN-γR−/−小鼠来源的类器官IECs上的MHC II不表达。

图2F-G. 共培养实验示意图（F）；IECs上MHC II的表达情况（G左）；DP在SP OT-II细胞中的比例（G右）。

IECs上经IFN-γ诱导产生的PD-L1在DP IELs分化中起到重要作用

通过上述实验知道MHC II+IECs能作为APC对CD4+IELs进行同源刺激后，研究者们推测它们也能表达其他能与MHC II一起协同调节T细胞的共受体。此外，由于MHC II在IECs上的表达依赖于IFN-γ的存在，研究者们进一步推测这些共受体应该与IECs中的IFN-γ信号有关。对经IFN-γ处理或不处理的小肠类器官进行RNA-seq分析，研究者们发现编码PD-L1蛋白的Cd274基因与MHC II关联基因的表达显著相关（图3A-B）。类器官实验（图3C）和体内实验（图3D-E）都表明IFN-γ能显著影响PD-L1表达量。为了进一步证实DP IELs分化需要IECs上PD-L1的表达，研究者们使用了PD-L1敲除小鼠（PD-L1−/−）、RAG-1敲除小鼠（RAG-1−/−，小鼠无成熟T、B细胞）、特异性在IECs中敲除了PD-L1目的基因的小鼠（PD-L1△IEC）以及由赛业生物构建的PD-L1fl/fl对照组小鼠。一系列实验结果（图F-H）都显示IECs上的PD-L1在DP IELs分化中起到了重要作用。

图3A-B. 差异表达基因热图（A）和火山图（B）。

图3C-E. （C）经不同浓度IFN-γ处理后，小肠类器官PD-L1的表达量;（D）与IFN-γR+/+小鼠对比，IFN-γR−/−小鼠中的PD-L1表达量显著降低；（E） 在IFN-γR+/+小鼠体内注射anti-IFN-γ抗体后，IECs上PD-L1的表达量显著降低。

图3F-H. （F）与PD-L1+/+小鼠对比，在PD-L1−/−小鼠回肠中，DP IELs比例明显下降；（G）将脾CD4+ T细胞输入到RAG-1−/−小鼠体内后，在小鼠体内加入anti-PD-L1抗体，DP IELs发育受阻；（H）与PD-L1fl/fl小鼠对比，在PD-L1△IEC小鼠回肠中，DP IELs比例明显下降。

微生物群对小肠中MHC II和PD-L1的表达以及DP IELs的分化至关重要

有报道显示小肠中IFN-γ的产生以及IECs上MHC II的表达都需要微生物群，因此，为了探究IECs上PD-L1的表达是否受到微生物群调控，研究者们使用了无菌（Germ-free，GF）小鼠、无特定病原体级（specific pathogen–free，SPF） 小鼠进行实验。这些实验结果表明：微生物群诱导产生的IFN-γ能刺激IECs表达MHC II和PD-L1，而这两者可以调节DP IELs的分化。

图4A. 与SPF小鼠对比，GF小鼠IECs上PD-L1的表达水平在回肠中显著降低、MHC II表达量和DP IELs比例在小肠各部位显著下降，特别是在回肠中。

图4B. 进行抗生素处理后，SPF小鼠中IECs上PD-L1的表达水平在回肠中显著降低、MHC II表达量和DP IELs比例在小肠各部位显著下降，特别是在回肠中。

图4C. 免疫荧光实验显示：SPF小鼠回肠中的IECs大多数都表达MHC II，20%表达PD-L1；而GF小鼠中，MHC II和PD-L1的表达量都显著降低。

PD-1信号通过抑制ThPOK表达来刺激DP IELs的分化

经典CD4+ T细胞和CD8+ T细胞分别靠表达T helper–inducing POZ/Krüppel-like factor （ThPOK）和runt-related transcription factor 3 （Runx3）来维持自身谱系。因此，DP IELs的分化需要Runx3表达量的上调和ThPOK的缺失。此外，IECs上MHC II和PD-L1的表达都对DP IELs的分化至关重要，这表明TCR和PD-1释放的信号可能参与了CD4+IECs的细胞重编程。前期实验结果显示：T细胞内源性的PD-1信号对DP IELs的分化是必需的（图5A-C）。为了进一步探究其中的分子机制，研究者们使用了ThPOK-GFP报告小鼠。实验结果显示：PD-1对ThPOK表达的抑制和DP IELs的分化需要PD-1信号的存在（图5D-E）。此外，体外实验结果（图5G-I）显示：PD-1信号通过经典的Src homology 2 domain–containing tyrosine phosphatase （SHP） 通路来下调CD4+IECs中ThPOK的表达，从而促进DP IELs的分化。

图5A-C. （A）C57BL/6野生型小鼠中，PD-1在不同IEL亚群中的表达情况。当SP IELs向DP IELs分化时，PD-1表达量下降。（B）与PD-L1+/+小鼠对比，在PD-L1−/−小鼠小肠中，DP IELs比例明显下降。（C）将来自于PD-L1+/+小鼠和PD-L1−/−小鼠的脾CD4+ T细胞1:1混合后，移植到RAG-1−/−受体小鼠体内。来源于PD-L1−/−CD4+ T细胞的DP IELs比例明显降低。

图5D-F. （D）实验示意图：将来源于ThPOK-GFP报告小鼠的脾脏T细胞移植到RAG-1−/−受体小鼠体内，并在重建期对受体小鼠进行anti-PD-1抗体处理；（E）ThPOK和Runx3的表达水平；（F）DP IELs的比例。

图5G-I. （G）将CD4+ T细胞和TGF-β、RA、PD-L1体外共培养3天后，测定ThPOKhi细胞比例。PD-L1介导了ThPOK的表达下调；（I-H） 将CD4+ T细胞和TGF-β、RA、PD-L1、SHP抑制剂（SHPi）体外共培养3天后，测定DP IELs的比例以及ThPOK和Runx3的表达水平。

综上，在这篇文章中，研究者们发现IECs是肠道中促进DP IELs分化的重要调控因素，起到了非典型APC的作用。肠道微生物群产生的IFN-γ可通过刺激IECs表达MHC II和PD-L1，对SP IELs提供TCR刺激和共受体信号，促进其向DP IELs分化。此外，研究者们还发现不同生理位置的IECs的基因表达谱会有所区别，而这也会影响它们周围的组织驻留型免疫细胞（例如DP IELs的分化）。

注：文中所有小鼠均为C57BL/6遗传背景

人体肠道微生物基因组作为人类的第二套基因组，与人类健康密切相关。大量的研究表明肠道微生物与包括心血管、肿瘤、免疫、神经、消化等多种疾病的发生发展密切相关，其因果关系也在逐步阐明中。