成年斑马鱼：长期地塞米松治疗可提高人乳腺癌细胞的植入率

摘要：宿主免疫系统倾向于排斥异种植入的细胞，从而使成年宿主动物模型中的肿瘤发展变得困难。 在许多免疫系统抑制动物模型中，可成功地将人类癌细胞异种移植。体内癌症发展过程的研究为理解癌症生物学和发现新的治疗策略提供了机会。斑马鱼是一种被广泛应用于癌症等人类疾病研究的模型。然而，作为人类癌症的异种移植动物模型，这些成年斑马鱼的长期免疫抑制作用仍在研究中。本研究用人乳腺癌细胞系MGSO-3细胞进行斑马鱼移植，观察地塞米松长期暴露21天的效果。结果表明，这些动物在接受地塞米松治疗的同时，外周淋巴细胞数量仍减少了50％。体外数据表明，地塞米松治疗长达7天不会改变MGSO-3细胞的形态，增殖或活力。接受长期地塞米松治疗的斑马鱼可以100%体内植入肿瘤细胞。在21天内这些动物也显示出肿瘤进展。只接受过地塞米松暴露的实验组在14天后肿瘤消退。总之，地塞米松在斑马鱼体内的长期应用，为异种移植瘤生长的体内监测以及抗癌药物的发现提供了一种潜在的策略。

关键词：乳腺癌  淋巴细胞  免疫抑制  异种移植  斑马鱼

简介：乳腺癌是一种世界性疾病，影响着各国的公共卫生。抗癌疗法已经改善了治疗方法，但这些疗法并不能发挥其功能，特别是在疾病处于晚期的情况下。精准肿瘤学由于有可能提高治疗效果而在医学领域发生了革命性的变化。精准肿瘤学的重点是为单个患者而不是群体优化治疗。这项单独的研究可以指导临床治疗决策，并推动一些药物的使用，这些药物可以调节特定的靶组织活性。利用病人来源的癌细胞异种移植的研究已经证明了利用斑马鱼作为预测预后和药物反应的模型的可行性，以确定对个别病人的理想治疗方法。吸引人的特征使斑马鱼成为测试抗癌疗法的极好模型。多项研究证明了该模型支持人源异种移植的能力，从而无需转基因小鼠即可直接研究人细胞。

在斑马鱼的胚胎中，免疫系统是不成熟的，不需要在肿瘤发展中使用免疫抑制剂。受精21天后，斑马鱼发展出功能完善的先天性和适应性免疫系统，移植的癌细胞被排斥。这被认为是一个限制，因为许多肿瘤类型主要发生在成人。幼年和成年斑马鱼异种移植试图克服这一限制，并为研究成年癌症的发展和代谢开辟了新途径。通过辐射和基因突变已经克服了产生免疫缺陷的成年斑马鱼的挑战。 这些免疫抑制类型可促进自发感染的脆弱性，导致几天内死亡。另一种实现免疫抑制的方法是将鱼暴露于地塞米松。一些研究表明，当动物暴露于地塞米松两天后，在斑马鱼中成功进行了几天的肿瘤细胞异种移植。我们假设长时间接触地塞米松可能使鱼体内的肿瘤细胞得以维持和发展。本研究旨在评估地塞米松对斑马鱼免疫系统的影响，持续21天。观察到地塞米松治疗的维持减少了外周淋巴细胞的数目，从而允许MGSO-3细胞有效移植21天。这项研究可能会带来有关使用成年斑马鱼作为了解人类癌症生物学和药物发现的模型的相关知识。

动物：成年斑马鱼雌鱼的体长和体重分别为3.70±0.60cm和0.46g±0.1。实验前，在实验室条件下斑马鱼在装有脱氯水（28°C）的10 L玻璃水族箱中和12/12 h光照/黑暗光周期中适应3周。均通过半静态系统强制通气。84个成年雌性斑马鱼被随机分配到3个装有脱氯水的10L水族馆中。每个水箱容纳28只动物，每箱动物接受一种类型的治疗：第1组不接受地塞米松的添加，因此被视为对照组。另外两组接受地塞米松，浓度为10 mg / L。第2组动物暴露于地塞米松48h（短时DEX组）。第3组的斑马鱼在整个实验过程中一直暴露于地塞米松（长时DEX组）。每48小时更新一次水族箱总水量的50%，补充地塞米松浓度。在每个实验时间（1、3、5和7天），从每个治疗组中取出7只动物，用三卡因（0.1 mg/mL）麻醉，并取血样。在获得血液后，这些动物在冰水浴中被安乐死。在分析的第一天，属于第2组和第3组的动物暴露于地塞米松。然而，在接下来的时间里，只有属于长时DEX组的动物使用地塞米松。在整个实验过程中，水温保持在32℃。

图1、长期地塞米松治疗可减少淋巴细胞数量。

流式细胞术定量淋巴细胞：用流式细胞术检测淋巴细胞和粒细胞的数量，以确认动物的免疫抑制。在分析的第一天，将短时DEX和长时DEX两组都暴露于地塞米松（10 mg / L），但是从第2天起，将短时DEX动物从地塞米松中移出。结果显示，在所研究的所有时间点，长时DEX组的淋巴细胞数量都有所减少。相反，短时DEX组仅在第一天观察到淋巴细胞数量减少。3天后，淋巴细胞恢复到基线水平。在整个实验过程中，粒细胞保持稳定。两种治疗方法（短期和长期DEX）随时间推移的淋巴细胞定量如图1所示。

地塞米松治疗不会改变MGSO-3细胞的增殖或代谢：将暴露于不同浓度地塞米松（0.01，0.1 ， 1 mg / mL）的乳腺癌细胞系MGSO-3的增殖行为与对照细胞进行了比较。结果表明，地塞米松治疗仅在治疗第1天以最低剂量改变MTT代谢，而在分析的3个时间点均未改变细胞MTT代谢，因此，在大多数测试剂量和时间内，在该细胞系中不呈现任何细胞毒性作用。此外，当MGSO-3细胞暴露于地塞米松时，其增殖曲线与对照细胞相似。与对照细胞相比，MGSO-3细胞同时达到了完全融合。地塞米松治疗后未见形态学改变。

图2、地塞米松对MGSO-3细胞MTT代谢及细胞增殖无明显影响。

成年斑马鱼荷瘤：对成年斑马鱼进行的荷瘤试验显示，无论地塞米松如何处理，33%的动物在注射7 dpi后肿瘤细胞注射的同一区域显示出荧光细胞。在14和21dpi后，长时DEX组100%的动物植入肿瘤细胞系，而短时DEX组植入肿瘤的动物百分比没有变化（33%）。另外，荧光面积的测量表明长时DEX组中动物的肿瘤增殖随时间增加，而短时DEX实验组中的荧光面积减少。结果表明，斑马鱼的免疫抑制作用超过18天具有6.6％的致死率。

图3.长期地塞米松治疗可使肿瘤生长21天

讨论：这项研究调查了长期地塞米松治疗对斑马鱼肿瘤细胞系移植效率的影响。我们的结果显示地塞米松影响肿瘤植入的早期阶段。但是，只有长期接受地塞米松治疗的动物才能成功保留异种移植物。结果表明，地塞米松对肿瘤细胞和动物的毒性较低。淋巴细胞定量显示的部分免疫抑制作用足以允许异种移植并防止动物死亡。辐射也被用来抑制成年鱼的免疫系统。然而，根据剂量的不同，单次照射可导致高致死率。除了高死亡率外，受照射的斑马鱼的免疫系统在数周后恢复，这可能引起肿瘤排斥反应。产生免疫缺陷斑马鱼模型的另一种策略是通过基因突变。暴露于地塞米松的动物外周血淋巴细胞计数的减少证实了这种药物的免疫抑制作用。地塞米松可通过抑制人类自然杀伤细胞和某些参与免疫应答的细胞因子（例如IL-2和IL-12）的细胞毒活性，从而破坏对细胞内病原体的先天免疫应答。

斑马鱼异种移植研究使科学家能够可视化肿瘤形成的各个方面，例如血管生成，迁移和转移。监测肿瘤发展和新药研究的可能性表明，斑马鱼在癌症研究中是合适且可靠的。斑马鱼体内快速的药物反应可以改善个体化治疗，提高治疗效果。我们的结果显示MGSO-3异种移植在长期实验中取得了成功，允许进行长期代谢和转移研究。进行了生长曲线测定和生存力测定，以验证地塞米松对MGSO-3肿瘤细胞生存力的影响，我们的结果表明，与对照组相比，随着时间的推移，细胞数和毒性作用没有变化。这些数据增强了地塞米松对肿瘤细胞生存力的安全性。 另一个相关方面是肿瘤细胞的形态特征没有改变。

总之，长期暴露于地塞米松可减少淋巴细胞的数量，这为斑马鱼MGSO-3肿瘤细胞的植入和生长提供了合适的环境。我们的研究表明，地塞米松治疗对MGSO-3细胞的存活率没有影响，证明了长期使用这种药物在斑马鱼体内进行肿瘤移植以进行癌症研究的潜力。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2667011921000025