泛素化是最普遍的蛋白质翻译后修饰之一。泛素通常与底物蛋白上的赖氨酸残基连接，但也可以结合非赖氨酸残基。以往的研究证明，赖氨酸残基的泛素化在多个细胞和生物学过程中起着重要作用，但非赖氨酸残基作为泛素化位点有何生理学意义，目前还知之甚少。

近日，海军军医大学安华章教授和袁红斌教授领导的研究团队在Nature Communications杂志上发表了题为“E3 ligase Nedd4l promotes antiviral innate immunity by catalyzing K29-linked cysteine ubiquitination of TRAF3”的论文，揭示了E3连接酶Nedd4l通过催化TRAF3中的K29连接的半胱氨酸泛素化来正向调控抗病毒免疫反应。

Nedd4l调控了抗病毒先天免疫

Nedd4l（又称Nedd4-2）是泛素连接酶Nedd4家族中的一员，属于HECT型E3泛素连接酶。它最为人熟知的功能是对上皮细胞的钠通道进行调控。在TGF-β信号通路中，Nedd4l下调了TGFβR1和Smad2以限制TGF-β信号传导。

为了研究Nedd4l是否在抗病毒先天免疫中起作用，研究人员使用了自发突变的Nedd4l缺陷型小鼠模型。他们从小鼠中分离出原代腹膜巨噬细胞，然后利用水疱性口炎病毒（VSV）感染。通过ELISA分析和RT-qPCR分析，他们发现，Nedd4l的缺乏会破坏病毒诱导IFN-β、IL-6和TNF-α的产生。

接下来，他们通过Nedd4l条件性基因敲除小鼠（由赛业生物提供）体内实验发现，骨髓中Nedd4l的缺乏并不影响主要免疫细胞群的发育。不过，Nedd4l的条件性缺失抑制了VSV诱导体内IFN-β和IL-6的产生。与对照小鼠相比，基因敲除小鼠脾脏和肝脏中的VSV复制和病毒滴度（TCID50）升高，存活率大大降低（图1）。这些结果表明，Nedd4l正向调控了巨噬细胞中I型干扰素和促炎性细胞因子的产生，对于体内抗病毒先天免疫至关重要。

图1. Nedd4l的条件性缺失抑制了体内的抗病毒先天免疫。 

Nedd4l直接与TRAF3相互作用

在感染VSV后，RIG-1样受体（RLR）会激活IRF3、NF-κB和MAPK，诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的产生。研究人员此次发现，Nedd4l的缺乏会抑制VSV诱导的IRF3磷酸化。通过进一步分析IRF3的上游分子，他们发现Nedd4l的缺乏减少了TRAF3/TBK1复合物的形成，而Nedd4l的过表达则增加了TRAF3与TBK1的结合。

为了阐明这背后的机制，他们研究了Nedd4l是否与MAVS、TRAF3或TBK1相互作用。通过免疫共沉淀等实验，他们发现在这三个分子中，只有TRAF3与Nedd4l发生相互作用。GST pull-down实验也证明了两者之间的直接相互作用（图2）。他们还进一步证明，Nedd4l通过其WW结构域与TRAF3结合。

图2. Nedd4l与TRAF3发生相互作用。 

Nedd4l对TRAF3的半胱氨酸残基进行泛素化

TRAF3的泛素化是病毒诱导TRAF3/TBK1复合物形成所必需的。由于Nedd4l与TRAF3存在相互作用，研究人员推测Nedd4l通过促进TRAF3的泛素化而增加TRAF3/TBK1复合物的形成。实验证实，Nedd4l的缺乏降低了巨噬细胞中VSV感染诱导的TRAF3泛素化。之后，他们利用一系列带有HA标记的Ub突变体（K11R、K29R、K33R、K48R、K63R）来鉴定多聚泛素链形成所需的赖氨酸残基。结果表明，仅K29突变破坏了Nedd4l介导的TRAF3泛素化，也就是说，Nedd4l直接催化了K29连接的TRAF3泛素化。

接下来，他们试图在TRAF3中鉴定Nedd4l催化的泛素化位点。通过LC-MS/MS分析，他们意外发现在Nedd4l过表达的细胞中，两个半胱氨酸残基C56和C124的泛素化也增加了，这两个残基参与构成了TRAF3中的RZ1和Z1锌指。C56和C124的突变显著降低了Nedd4l催化的K29连接的泛素化，表明C56和C124残基是Nedd4l催化的泛素链所连接的泛素化位点（图3）。后续的分析表明，RZ1和Z1锌指的调节或破坏会增加TRAF3泛素化。

图3. Nedd4l对TRAF3中的半胱氨酸残基进行泛素化。 

此外，TRAF3也被其他E3连接酶泛素化，比如cIAP1/2和HECTD3。于是研究人员又分析了Nedd4l是否影响TRAF3与其他E3连接酶之间的相互作用。他们发现，Nedd4l缺乏降低了TRAF3与cIAP1/2和HECTD3的相互作用，而过表达则促进了它们之间的相互作用。C56和C124突变则更有效地招募了TBK1以形成TRAF3/TBK1复合物，并增加了VSV诱导的IFN-β、IL-6和TNF-α 的mRNA表达，证明了半胱氨酸残基在调控病毒诱导的先天免疫中很重要。

这项研究表明，Nedd4l通过催化TRAF3中K29连接的半胱氨酸残基的泛素化来促进VSV和LPS诱导的I型干扰素产生。作者认为，这不仅表明Nedd4l是抗病毒先天免疫的关键调控因子，也表明TRAF3泛素化的调控环境比以前预期的要复杂得多。同时，这项研究也显示了半胱氨酸泛素化在先天免疫中的重要性。

原文检索：

Gao, P., Ma, X., Yuan, M. et al. E3 ligase Nedd4l promotes antiviral innate immunity by catalyzing K29-linked cysteine ubiquitination of TRAF3. Nat Commun 12, 1194 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21456-1.