裸兔模型的开发

简介：FOXN1基因的功能丧失突变导致严重联合免疫缺陷，这是一种罕见的遗传综合征，其特征为无胸腺，严重的T细胞免疫缺陷，先天性脱发和指甲营养不良。我们最近通过使用CRISPR-Cas9生产了FOXN1突变裸兔模型（NuRabbits）。裸兔像裸鼠一样，是无毛的，缺乏胸腺发育，并且免疫缺陷。为了证明裸兔在生物医学研究中的功能应用，我们证明了它们可以成功地用作人源性多能干细胞或组织工程血管的异种移植实验中的受体动物。我们的工作提出了NuRabbit作为免疫缺陷动物模型家族的新成员。裸兔体型较大，寿命长，在再生医学、癌症研究以及包括免疫缺陷在内的各种其他人类疾病的研究中有独特的应用。

关键词：裸兔  FOXN1  免疫缺陷  干细胞  异种移植

简介：裸鼠（NuMouse）作为一种实验性动物模型，已被广泛应用于免疫学、肿瘤研究、干细胞治疗、皮肤再生等生物医学领域。裸表型是由FOXN1基因突变引起的，该基因在胸腺和皮肤上皮细胞的分化中起着关键作用。在人类患者中，FOXN1基因的功能丧失突变导致裸露的联合免疫缺陷表型，包括先天性脱发，指甲营养不良和T细胞免疫缺陷。裸鼠的一个主要应用是作为同种异体和异种移植研究的受体动物，利用它们严重受损的免疫反应表型的优势。例如，在干细胞畸胎瘤试验中，人类胚胎干细胞（ESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）通常被移植到裸鼠体内，以评估由此产生的畸胎瘤的生长速度。这种方法代表了目前有关ESC和iPSC的功能评估的金标准，涉及到它们分化为多种组织类型的能力。我们最近报道了由CRISPR-Cas9介导的涉及淋巴细胞发育或功能的基因的破坏，例如IL2RG，RAG1，RAG2，PRKDC和FOXN1，从而产生免疫缺陷兔。我们推断，一个比小鼠更大体型和更长寿命的免疫缺陷动物模型可能在许多转化研究中被证明是有用的。在本研究中，我们报告了FOXN1突变体裸兔的发展和特征，并证明了它们在异种移植实验中作为受体的用途。

裸兔克隆体的建立：以前我们通过CRISPR-Cas9介导的基因破坏产生了FOXN1突变兔。创始动物（F0）为mosaic，携带野生型（WT）等位基因，该等位基因编码由667个氨基酸（aa）和一个或多个突变等位基因组成的全长FOXN1蛋白。目前的工作基于创始兔体内的三个不同的突变等位基因：（1）Δ5，缺失5 bp，预计会导致脯氨酸在第84位氨基酸（P84）处发生移码，截短大小为120 aa。（2）Δ10，缺失10 bp，预计会导致苏氨酸在第81位（T81）的氨基酸处移码，截短大小为299 aa；（3） Δ11，缺失11bp，预测会导致谷氨酰胺在第83位的氨基酸处（Q83）移码，截短大小为118aa。

图1. 裸兔克隆体的建立

为了建立FOXN1基因缺失兔作为研究资源，首先培育了两只F0兔并与WT繁殖了F1代动物，评估种系传播能力。两只F0代均证明自己是可育的。总共21个子代中有10个（47.6％）是杂合的FOXN1突变体（FOXN1 +/-）。 在这10个中，有2个带有Δ5，3个带有Δ10，而5个带有Δ11突变等位基因。接下来，我们证明了FOXN1+/-兔（即wt/Δ5、wt/Δ10或wt/Δ11）可用于建立和维持裸兔群体。所有F1代FOXN1 +/-兔子，无论其特定的突变类型如何，都是健康的，并且与野生型动物在表型上没有区别，并且可以成功地安置在常规动物设施中。迄今为止，我们已经通过F1 FOXN1 +/-动物的杂交繁殖产生了6窝。总共产生了39个子代，包括8 个WT（21％），19个 FOXN1 +/-（49％）和12个 FOXN1null（30％），接近孟德尔分布。我们还测试了FOXN1null兔是否有生育能力，是否可以用于群体维持。在一次试验中，一只成年FOXN1Δ11/Δ11雄性与三只FOXN1wt/Δ11雌性共育17个个体，其中12个为FOXN1Δ11/Δ11，5个为FOXN1wt/Δ11。通过口服预防性抗生素和加强饲养卫生措施，FOXN1null兔可以活1年以上。

裸兔的裸露外观：不管是哪种突变类型，FOXN1null兔都表现出标志性的裸体表型，因此被称为NuRabbits。相反，WT和FOXN1+/-兔子没有任何脱发迹象。这种表型上的差异使得视觉识别NuRabbits成为可能，即使没有PCR或基于测序的基因分型分析。在这三种突变基因型中，与Δ11/Δ11动物相比，Δ5/Δ10和Δ5/Δ11NuRabbits表现出更高的无毛程度。

图2. 裸兔的裸表型

（A–C）5周龄时不同基因型的NuRabbits。 （A）Δ5/Δ10，（B）Δ5/Δ11，（C）Δ11/Δ11。（D）Δ5/Δ11NuRabbit（左）和WT兔（右）中毛囊的代表性显微照片。NuRabbit的皮肤部分（左）的特征是扩张的滤泡性口（箭头），其中包含不同量的角蛋白碎片或不规则的毛干，伴有滤泡上皮变薄以及滤泡中皮脂腺的数量和大小减少（箭头） 与WT兔子（右）的毛皮肤相比，WT兔子的毛皮肤具有发达的皮脂腺单位（箭头）和多个毛囊，每个附件都有完整的毛干（箭头）。

NuRabbit皮肤的组织学分析显示滤泡口扩张，含有不同数量的角蛋白碎片，或不规则形成的毛干，伴有滤泡上皮变薄，滤泡附件内皮脂腺数量和大小减少。NuRabbits的头发生长表现为周期性。 例如，在Δ5/Δ10NuRabbits中，在出生后的头2至3周内，NuRabbits上的头发稀疏和卷曲，比非裸兔（即WT和FOXN1 +/-）上的少得多。严重脱发开始于大约4周龄，大约1周后达到高峰，有些动物几乎完全脱发。此阶段之后是第6周的毛发再生长，最终稳定为一种表型，其特征是脖子和上背部缺乏毛发，而身体其他部位的毛发稀疏。NuRabbits的其他表型包括弥漫性趾甲营养不良和随时间推移与WT同窝仔兔相比体重略低。

NuRabbits免疫缺陷：

淋巴组织缺损：验尸后，NuRabbits的淋巴组织明显减少或消失。胸腺通常大体上无法辨认，其他淋巴组织（如脾脏和淋巴结）也明显缩小。组织学上，淋巴组织缺失或明显减少是主要的表型改变。与野生型不同，其胸腺皮质和髓质区域具有适当的厚度和足够数量的皮质淋巴细胞，NuRabbit的胸腺通常缺乏所有的淋巴元素，在疏松的结缔组织间质内只有髓质胸腺细胞的残余和少量散在的单核细胞和粒细胞。同样，在脾脏中，与野生动物相比 其白髓和红髓充分呈现，在动脉周围淋巴鞘（PALS）区域内有密集的T淋巴细胞带和多个大小不等的B淋巴细胞滤泡，而NuRabbits脾脏体积明显缩小，所有淋巴成分缺乏，无PALS和淋巴滤泡，仅存少量小的单个淋巴细胞簇和散在的粒细胞。

图3. NuRabbits免疫缺陷

（A） NuRabbits胸腺发育不足（右），而野生型兔胸腺发育正常（蓝色圆圈）。（B）与NuRabbits（右）相比，野生型兔的胸腺（bar，100μm），脾（bar，50μm）和阑尾（bar，20μm）的切片。与WT兔胸腺皮质淋巴区（箭头）相比，NuRabbits的淋巴成分明显减少，胸腺小叶疏松结缔组织基质中仅残留少量细胞簇。WT兔的脾脏有大的淋巴滤泡（箭头），而NuRabbits的淋巴组织普遍缺乏，只剩下小的残余物（箭头）。在阑尾切片中，WT兔的固有层内有密集的淋巴组织片，相比之下，NuRabbits中淋巴细胞的片状缺失，伴有结缔组织细胞碎片（箭头）和吞噬退化淋巴细胞的巨噬细胞（箭头）。

（C） WT和NuRabbits患者外周血淋巴细胞流式细胞术的典型结果。（D）相比，七只NuRabbits与三只野生型兔外周血中B和T细胞群体的比较。

肺中普遍缺乏支气管相关淋巴组织，胃肠道相关淋巴组织中淋巴细胞减少。外周淋巴结中淋巴细胞数量普遍减少，阑尾和圆小囊中淋巴细胞减少。

NuRabbits外周血T细胞缺乏症：从NuRabbits的耳中央动脉采集外周血，分析循环淋巴细胞的数量。流式细胞仪检测显示，与野生型兔相比，NuRabbits的T淋巴细胞百分率显著降低。关于T细胞亚群，CD8阳性T细胞群几乎被消除，而CD4阳性T细胞从30％显着降低到4％。 但是，B淋巴细胞仍在正常参考范围内。

NuRabbits容易肺部感染：在没有预防性抗生素的情况下，NuRabbits（n=5）普遍出现呼吸道感染的症状和体征，最终死于呼吸衰竭。在一名因濒死状态而被安乐死的NuRabbits上，尸检发现支气管肺炎，其组织学特征为肺实质多灶性实变，气道充满中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性蛋白物质和细胞碎片，符合细菌性支气管肺炎。这些发现与NuRabbits的免疫缺陷表型相一致，该表型与裸鼠的观察结果相呼应，并支持将NuRabbits用作裸严重联合免疫缺陷（SCID）研究的模型动物。

NuRabbits支持来源于人类iPSCs的畸胎瘤生长：除了用作疾病模型外，裸体动物还经常被用于利用人类干细胞或肿瘤细胞的异种移植研究，利用其免疫排斥反应受损的优势。我们致力于证明NuRabbits支持使用人类iPSCs进行畸胎瘤试验的异种移植实验。

图4、NuRabbits支持iPSC衍生的畸胎瘤生长。

（A） NuRabbits畸胎瘤试验图解。（B） NuRabbits畸胎瘤形成概述。（C） NuRabbits和NuRabbits小鼠畸胎瘤的代表性图片。

利用两个不同年龄组的七只动物。植入iPSC时，A组（n=3）NuRabbits（NuRabbits-A）为7-9周龄，B组（n=4）NuRabbits（NuRabbits-B）为2-3周龄。每只NuRabbit的后腿肌肉注射1×106个iPSCs。对照组采用6周龄裸鼠（n=2），每只后腿接受1×106个iPSCs。在实验终点，安乐死后切除肿瘤，并测量每个畸胎瘤的最长轴（Dmax）和最短轴（Dmin）的长度作为畸胎瘤大小的指标。在A组中，畸胎瘤在两只动物的所有四个注射部位中生长，但在第三只动物的两个注射部位中没有生长（4 / 6，67％）。相比之下，B组动物在8个注射部位中有8个畸胎瘤生长（100%），表明2-3周龄的NuRabbits可能比7-9周龄的NuRabbits更适合iPSC畸胎瘤生长。此成功率与对照组NuMice组的成功率相似，在该组中，两只动物的所有四个注射部位都有畸胎瘤生长（100％）。

组织工程血管移植到NuRabbit的实验研究：接下来，我们在Δ5/Δ10 NuRabbit中使用患者特异性干细胞衍生的组织工程血管（TEBVs）进行移植实验。人类iPSC衍生的平滑肌细胞（SMC）用于产生TEBV。TEBV的直径在2-3 mm的范围内，与兔颈总动脉（CCA）的直径相似，但比小鼠CCA的直径（约0.5 mm）大得多。小鼠的体积小，因此其血管的体积小，对TEBV移植程序具有抑制作用。 相反，成年NuRabbit的大小类似于人类婴儿的大小，并且其CCA的大小允许进行实践移植。实际上，通过外科手术，TEBV成功移植到了左CAA，并且6月龄的NuRabbit恢复了血流。TEBV移植实验证明了NuRabbits相对于免疫缺陷小鼠的体积优势。

图5、TEBV在NuRabbit的移植。 （A） 患者特异性干细胞衍生的TEBV的图示。（B） 成年小鼠（左）和成年兔（右）颈总动脉的代表性图像。（C） TEBV的代表。（D）移植到NuRabbit中的左颈总动脉后的TEBV的代表性图像。

总之，我们已经建立并维持了一个NuRabbits群体；将其表型描述为无毛发、无胸腺和免疫缺陷；并验证了它们在干细胞异种移植实验中的应用。这种新的动物模型在转化生物医学研究中有着广泛的应用前景。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671121000400