斑马鱼早期生命阶段作为研究“设计毒品”的替代模型：与哺乳动物对阿片类药物的反应一致

摘要：非法药物市场上的新型精神活性物质（NPS）的数量迅速增加，因此有必要紧急了解其毒性和行为影响。然而，目前可用的啮齿动物模型，NPS评估仅限于每年少数物质。因此，已经提出了斑马鱼的胚胎和幼虫作为替代模型，它将需要较少的时间和资源来进行初步评估，并且可以帮助确定物质的优先级以便随后在啮齿动物中进行评估。为了验证该模型，需要更多有关斑马鱼幼虫和哺乳动物对特定类别NPS反应的信息。在这里，我们研究了阿片类药物在斑马鱼生命早期阶段的毒性和行为影响。合成阿片类药物是一类NPS，常作为止痛药，但也经常滥用，最近已引起多种中毒和死亡事故。我们的数据表明，芬太尼衍生物在所测试的阿片类药物中毒性最高，斑马鱼胚胎毒性试验中的毒性按以下顺序降低：丁苯芬太尼> 3-甲基芬太尼>芬太尼>曲马多> O-去甲基曲马多>吗啡。与啮齿动物相似，曲马多、芬太尼及其衍生物导致斑马鱼幼虫的低活性行为，其中3-甲基芬太尼作用最强。基于理化性质的斑马鱼胚胎和仔鱼对化学物质吸收的预测与观察到的效果有很好的相关性。此外，丁苯芬太尼在斑马鱼幼虫中的生物转化模式与人类相似。斑马鱼和啮齿动物对阿片类药物的毒性和行为反应的比较支持斑马鱼作为快速测试合成阿片类药物的合适替代模型。

关键词：新的精神活性物质  斑马鱼  阿片类药物  毒性  行为学  生物转化

简介：新的精神活性物质（NPS），也称为“设计毒品”，正在快速发展中。欧洲药物和药物成瘾监测中心（EMCDDA）记录了730多种NPS，其中50％仅在最近五年才被发现。合成大麻素（30％），卡西酮（30％）和阿片类药物（5％）是已记录和监测的主要NPS类别。尽管合成类阿片仅占EMCDDA已知的所有NPS的一小部分，但它们特别令人关注，主要有三个原因：（a）阿片和类阿片通常用于止痛，导致它们在合法和非法两方面的大量使用；（b）它们非常有效，因此剂量上的小误差都可能导致致命的过量（c）秘密实验室经常生产无医疗用途的合成类似物，并经常以海洛因为名出售。阿片类药物主要通过与mu（μ）、kappa（κ）或delta（δ）阿片受体结合而起作用，并且可以产生镇痛作用，麻醉作用，镇静作用和嗜睡感。即使是主要通过结合mu受体发挥作用的阿片类药物，也存在差异。这可以通过例如受体的亲和力和效力的差异来解释。因此，阿片类药物可分为低效、中效和高效阿片类药物。阿片类药物滥用的主要问题与高效能的合成阿片类药物有关。许多NPS缺乏有关毒性和作用机理的数据，通常只有特定群体的少数代表可以从动物毒性试验或人类使用者的经验中获得一些信息，从而可以判断其效力。由于资金有限以及基于啮齿动物的毒性试验的时间和资源密集性，每年只能对几种其他物质进行毒理学表征。鉴于市场上引入NPS的快速步伐以及全球用户对NPS的日益增长的需求，这显然是不够的。虽然体外试验可以为一些终点的快速检测提供额外的手段，但目前尚不能取代药物使用者可能出现的复杂效应的检测，如行为反应、慢性毒性和发育毒性。因此，如果有一个代表整个动物反应的替代动物模型，这将是有益的，这将使测试NPS毒性比目前啮齿动物更快和更有效。这种替代方法可能涉及用斑马鱼胚胎和早期幼虫进行试验，在了解药物的药理学，特别是毒性和行为效应方面，作为补充啮齿类动物的试验生物，斑马鱼胚胎和早期幼虫已经越来越受欢迎。斑马鱼的早期生命阶段，从受精到开始独立喂养，被认为是一种可供选择的非动物试验系统。该模型在人体危害评估中有多种应用，包括急性全身毒性、慢性毒性、致畸性、神经行为和特定器官毒性。斑马鱼和哺乳动物具有高度保守的药理作用靶点。研究表明，鱼类和哺乳动物对引起生殖毒性，行为影响，致畸性，致癌性，心脏毒性，耳毒性或肝毒性的小分子的反应高度相似。斑马鱼阿片受体的表达和功能在生物学和药理学上与哺乳动物（包括啮齿动物和人类）相当。此外，斑马鱼阿片受体转录物可以在发育早期（受精后3小时之前）检测到。包括斑马鱼在内的鱼类对疼痛的感知已经得到了很好的研究，而行为研究常常被用作研究疼痛的指标。本研究的目的是评估斑马鱼在早期生命阶段对阿片类药物的毒性和行为反应。通过测试几种属于不同效力类别的阿片类药物，我们解决了以下研究问题：（a）与哺乳动物相比，阿片类药物在斑马鱼的早期阶段是否引起相似或不同的毒性和行为效应；（b） 在哺乳动物中具有不同效力的阿片类物质在斑马鱼中是否遵循相同的模式以及（c）在斑马鱼幼虫和哺乳动物之间阿片类物质的生物转化是否存在相似性。

斑马鱼胚胎毒性试验中的致死和亚致死作用：

图1、阿片类药物的发育毒性。

采用斑马鱼胚胎毒性（zFET）试验，测定胚胎在受精后0～5d暴露于不同阿片类药物（A-F）下的LC50和EC50，并监测其死亡率和异常情况。在zFET试验或RFT试验中，即使在最高浓度为25 mM时，试验浓度的吗啡也没有引起任何剂量依赖性死亡率。在zFET试验中也没有观察到发育毒性。因此，无法确定吗啡的LC50或EC50。曲马多在zFET试验中没有引起死亡。因此，LC50是通过RFT测定的，在RFT中观察到了卵子凝固和心跳不足等致命影响。在50μM和更高浓度的zFET试验中观察到亚致死效应，如变形的脊索。这些影响在孵化后变得很明显。 在较低浓度下，偶尔会出现孵化延迟。 但是，到5 dpf时，所有幼虫都孵化了。与曲马多相似，O-去甲基曲马多在zFET试验中没有造成致死性，LC50是根据RFT计算的。在孵化后的zFET试验中，偶尔观察到亚致死效应，如脊索变形，但未发现药物浓度依赖效应。因此，无法确定O-去甲基曲马多的EC50。在zFET试验中，暴露于芬太尼引起剂量依赖性死亡率。无心跳是主要致死终点。累积死亡率随时间增加，尤其是孵化后。早在48hpf时就观察到亚致死效应，并且在治疗期间，亚致死效应的数量和严重程度稳步增加。孵化前的主要亚致死效应是心包水肿、卵黄囊水肿和心率减慢。与芬太尼相似，但效力更高，3-甲基芬太尼在zFET试验中引起剂量依赖性死亡率。卵子凝固和心跳不足是主要的致死效应。亚致死效应在最低浓度（0.001μM）时已经出现，并且随着剂量的增加而增加，在最高浓度50μM时影响100%的幼虫。孵化前出现生长停滞、心包水肿和心率减慢。孵化后，还发现畸形的绒毛膜和卵黄囊水肿。在所测试的化合物中，丁苯芬太尼是最有效的，在两个最高浓度下观察到最低的LC50值和100%的死亡率。缺乏心跳是观察到的主要致死作用。 与3-甲基芬太尼相反，亚致死效应仅发生在5μM及以上，包括心包水肿，畸形的绒毛，生长停滞和心跳减慢。

短期毒性测试以确定最大无毒浓度：为了确定运动行为实验中使用的最大无毒浓度（MNTC），从4 dpf开始进行了24h的短期暴露。对于吗啡，未进行此测试，因为从zFET测试中未观察到任何形态学影响，因此将50μM的浓度用作行为研究的最高浓度。对于曲马多，除最高浓度的一个胚胎外，在所有试验浓度下均未观察到任何影响。同样，暴露于O-去甲基曲马多的幼虫在24小时暴露期间，在任何测试浓度下均未显示出任何影响。用最高浓度的芬太尼处理的幼虫显示心包水肿和卵黄囊水肿，而在较低浓度下未观察到影响。短期暴露于15和25μM 的3-甲基芬太尼会导致死亡，暴露于10μM及以上的浓度会导致异常，包括心包水肿，心律不齐，卵黄囊水肿和头部和脊柱畸形。浓度为10μM或更高的丁苯芬太尼会引起亚致死作用，例如姿势失衡和心脏水肿。

运动活动：通过监测幼虫的运动活动来评估对行为的影响。开始产生显著行为效应的浓度称为最低显著行为效应浓度(LSBEC)。为了确定吗啡和曲马多对斑马鱼幼虫行为的影响，对低和高两个浓度范围的运动活动进行了评估。在任何测试浓度下，吗啡在低或高范围内都没有显著改变运动。因此，不能确定吗啡的LSBEC。 在高浓度范围内，曲马多暴露的幼虫的运动能力下降，浓度≥1μM时影响显著。在任何测试浓度下，O-去甲基曲马多均不会显著改变幼虫的运动。因此，不能确定O-去甲基曲马多的LSBEC。 芬太尼在1μM及以上时，在刺激条件下（即黑暗），显著降低幼虫的运动能力。3-甲基芬太尼在光照和暗照条件下从0.01μM开始以剂量依赖性方式显著降低运动活动。 在黑暗中从1μM开始，丁苯芬太尼以剂量依赖性方式显着降低运动活动。

图2、阿片类物质对斑马鱼幼虫运动行为的影响。受精后5天（dpf）幼虫暴露于不同浓度的阿片类药物（A-F）对运动活动进行了追踪。

吸收和生物转化：在哺乳动物中，曲马多的镇痛活性主要由其代谢物O-去甲基曲马多驱动。在我们的研究中，当我们分别观察这些化合物的毒性和行为效应时，尚不清楚曲马多的效应是由曲马多本身还是其生物转化产物引起的。因此，我们分析了斑马鱼的幼虫是否可以生物转化曲马多。 为了分析曲马多向O-去甲基曲马多的生物转化，将斑马鱼的幼虫暴露于与运动活性测定所用浓度相似的高浓度曲马多下70 min。随着暴露浓度的增加，曲马多的浓度增加。然而，在所有分析样本中均未检测到O-去甲基曲马多。O-去甲基曲马多的定量限（LOQ）约为0.001μM。 可以测量的最低曲马多浓度比O-去甲基曲马多的LOQ高10倍。

图3. 斑马鱼幼虫中丁笨芬太尼（BF）的吸收动力学和生物转化。 将5 dpf的幼虫暴露于5μM BF中长达10小时。 在不同时间点，通过LC-MS / MS测量全身匀浆中的丁苯芬太尼和代谢物。

总之，斑马鱼的胚胎和幼虫对合成的阿片类药物敏感，其毒性和行为效果与啮齿类动物相当。 此外，低，中和高效阿片类药物在斑马鱼和哺乳动物中显示出相似的反应模式，而且丁苯芬太尼的生物转化也具有可比性。斑马鱼的早期阶段似乎代表了一种有前途的模型，可用于NPS早期筛查，从而可以迅速获得有关该药物的毒性和行为影响的信息。

原文出自：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041008X21000909