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模型制备

卵清蛋白诱发大鼠变态反应性结膜炎模型

2021年04月08日 浏览量: 评论(0) 来源:《眼科实验动物学》 作者:魏世辉、王志军 主编 责任编辑:yjcadmin

1.原理  将卵清蛋白于大鼠腹腔注射,使其产生IgE抗体,IgE抗体与结膜组织中肥大细胞的受体结合而主动致敏。当用抗原进行局部攻击时,引起激活的肥大细胞脱颗粒释放过敏介质,从而使局部血管的通透性增加,并伴有局部嗜酸细胞浸润,注入偶氮蓝(伊文思蓝),可渗出于眼组织内,引起组织水肿,根据结膜水肿程度、嗜酸细胞浸润及肥大细胞脱颗粒程度以及结膜组织提取液的光密度,判定血管通透性变化,以反映结膜变态反应的程度:DL-二巯基苏糖醇(DDT)是黏液溶解剂,它可破坏结膜黏液屏障功能,使卵清蛋白这种大分子物质可以穿透入结膜,与组织内的IgE抗体结合,增强眼部变态反应。

2.模型制作方法  Wistar大鼠,体重250~300mg,雄性。预先给大鼠腹腔注射卵清蛋白磷酸盐缓冲液(PBS)1ml(含卵清蛋白100μg,硫酸铝钾20mg)免疫。14d后,各眼滴1mol/L的DL-二巯基苏糖醇(DTT)溶液20μl,以消除结膜黏液屏障,提高致病效果。15min后按1.25mg/100g体重于鼠尾静脉注射偶氮蓝(EB)溶液1ml,并立即用微量加样器取10%卵清蛋白PBS液10μl滴眼攻击。

3.观测指标与分析

(1)结膜病变程度观察及评分:局部抗原攻击后30min,裂隙灯下判断组织反应。用下列计分法对反应定量(每眼最多10分)。

①血(睑结膜和球结膜)。0分,正常;1分,结膜呈粉色;2分,结膜呈红色;3分,结膜呈暗红色,有瘀点、

瘀斑。

②水肿。O分,无;1分,仅下眼睑水肿;2分,上下眼睑均水肿,眼睑部分闭合;3分,眼睑外翻,水肿明显,眼睑至少半关闭;4分,上下睑及睑缘均水肿。

③分泌物。0分,无;1分,稀黏液状;2分,眼睑及周围的毛发潮湿;3分,眼睑及周围的毛发潮湿,稠黏液状。

(2)结膜血管通透性判断(偶氮蓝含量测定):卵清蛋白PBS液滴眼攻击后30min,放血处死大鼠,取出眼睑、结膜和眼球,去除脂肪,称重后分别置入预先备好的0.5%硫酸钠和丙酮混合液(3:7混合)5~10ml,室温下振荡,24h后将溶液于300r/min离心10min,吸取上清液,用分光光度计在620nm处比色测定光密度。依组织称重换算为EB含量。

(3)组织学检查:抗原攻击后30min切除上方球结膜制备光镜标本,将组织固定在Karnovsky's固定液中,乙醇梯度脱水,异丁烯酸乙二醇包埋,切片厚2μm,HE,PAS及碱性Giemsa染色,光镜观察。用网格为0.25mm×0.25mm网状计数尺在3个不同的视野内对结膜上皮、上皮下组织及基质组织中的肥大细胞和嗜酸细胞计数。阳性组结膜上皮内及基质内嗜酸细胞大量浸润,脱颗粒的肥大细胞明显增多;脱颗粒肥大细胞与肥大细胞总数之比值明显增高。

(4)偶氮蓝(EB)渗出抑制率测定:药物的治疗作用通过与相应生理盐水治疗眼比较而计算得到,渗出抑制率按公式I=(P-D)/P×100%计算,其中,I表示渗出抑制率,D为药物治疗眼的平均EB渗出量,P为相应生理盐水治疗眼的平均EB渗出量。


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