斑马鱼从仔鱼到幼鱼过渡阶段：atg7和beclin1对能量代谢和生存至关重要

摘要：仔鱼向幼鱼过渡期死亡率高是水产养殖面临的一大难题，这与从内源性摄食向外源性摄食的转变有关。但是，根本原因仍然知之甚少。 自噬是一种进化调控的细胞机制，在真核生物中高度保守，以维持机体的能量平衡以抵抗包括饥饿在内的应激。为了研究自噬是否在仔鱼到幼鱼的转化过程中发挥作用，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术产生了atg7和beclin1斑马鱼突变系。在本研究中，由于atg7和beclin1突变体不能应对卵黄吸收后的代谢应激，也不能激活自噬以应对营养限制，所以atg7和beclin1缺失斑马鱼在仔鱼到幼鱼过渡期死亡。同时，这些突变体的肠道结构和肝脏代谢功能也出现了明显的缺陷。雷帕霉素是一种自噬激活剂，通过降低代谢率，有效地延长了atg7和beclin1缺失斑马鱼的存活时间，但不能通过经典途径激活突变体的自噬。因此，我们的研究结果表明，自噬在斑马鱼从仔鱼到幼鱼的个体发育过程中起着至关重要的作用，自噬可以被认为是决定发育中胚胎存活率的最重要的内源性因素之一。

关键词：自噬  仔鱼到幼鱼过渡期  atg7   beclin1  新陈代谢  雷帕霉素

简介：在水产养殖中，尽管人工授精可以获得很高的受精率和孵化质量，但是在仔鱼向幼鱼过渡过程中发生了高死亡率，但原因尚不清楚。从内源到外源之间的短暂过渡期是未来胚胎发育的有效参数，控制着主要代谢器官的发育。据报道，在不同类型鱼类的早期发育过程中，从仔鱼到幼鱼是一个快速的时期，涉及许多形态，生理，分子和行为适应，需要消耗大量的能量。在早期发育过程中，幼虫在母体卵黄被完全吸收后，通过细胞分解代谢途径获得能量进行生物合成活动，直至转入外源性摄食。巨噬细胞吞噬（此处称为自噬）是一种细胞分解代谢途径，参与胚胎发育过程中分化和生长所需的胞质重排，可介导细胞蛋白质和细胞器的更新，并在数小时内为其提供新的构建基块。在自噬的基础研究中，有30多个自噬相关基因参与了自噬机制的构建，其中包括两个关键基因beclin1和atg7。Beclin1充当一种支架蛋白，与Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和Vps34形成复合物，并介导囊泡运输过程和吞噬体的形成。同时，Atg7（类似E1的酶）对于激活泛素样蛋白Atg12与Atg5的结合也是必不可少的，并调节前LC3脂质化以增加囊泡膜的伸长。在仔鱼到幼鱼的过渡期结束时，延迟初始摄食可以启动鱼类的自噬，因为自噬受雷帕霉素（mTOR）的机制靶点控制，丝氨酸-苏氨酸激酶在禁食和摄食条件下调节合成代谢和分解代谢过程。在营养丰富的条件下，mTOR被激活并刺激合成代谢过程，包括糖异生，蛋白质合成和能量代谢，而通过自噬的分解代谢途径被禁止。此外，再进食可诱导mTOR的再激活，从而减弱自噬并启动溶酶体再生。此前，有报道称糖酵解和柠檬酸循环是鱼类发育过程中的主要能源。然而，野生型斑马鱼推迟到8dpf的摄食期并没有影响其存活率，这说明在发育过程中存在另一条代谢途径，使仔鱼进入安全状态，自噬可能是其原因之一。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术产生了atg7和beclin1斑马鱼突变系，以研究自噬在仔鱼向幼鱼过渡过程中的作用。

CRISPR / Cas9产生atg7和beclin1突变体：利用CRISPR/Cas9系统产生斑马鱼突变体。简单地说，sgRNA靶向位点分别选择在atg7和beclin1的第10和第4外显子。最后，建立了两个分别含有5-bp（atg7Δ5）和2-bp缺失（atg7Δ2）的atg7突变株系，并用反向测序法获得了靶位点序列。斑马鱼Atg7蛋白由ATG-N超家族和E1酶超家族两个功能域组成。Atg7Δ5和Atg7Δ2的缺失导致提前终止密码子引起的移码，该密码子影响突变体中的蛋白质结构域。在基因突变的另一侧，建立了一株含有8-bp缺失的beclin1突变株系，命名为beclin1Δ8。靶位点测序显示碱基对缺失，采用正向基因分型法进行基因分型。斑马鱼Beclin1蛋白由两个功能域组成，包括BH3和APG6超家族。Beclin1Δ8的缺失导致突变系中提前终止密码子引起的移码。

图1. atg7和beclin1突变斑马鱼的生成

斑马鱼仔鱼向幼鱼过渡期间atg7或beclin1功能丧失会导致致死性：当雄性和雌性atg7+/-或beclin1+/-斑马鱼杂交时，在其后代的早期胚胎发育过程中没有观察到明显的缺陷。有趣的是，在仔鱼发育过程中，atg7和beclin1纯合子突变体与同一种群的野生型和杂合型相比，表现出更不透明的肝脏。为了阐明这个问题，在7dpf时进行了整体油红O染色。结果表明，atg7和beclin1突变体的肝脏和beclin1-/-的整个GIT中都有脂质积累，而野生型和杂合子仔鱼的表型基本相同，没有脂质积累。在斑马鱼中，根据内源性摄食，母卵黄在5-6 dpf后几乎耗尽，而没有外源性摄食，野生型斑马鱼幼虫早在8-9 dpf时就开始死亡，并在13 dpf时完全死亡。同时，atg7和beclin1纯合突变体分别死于6到9 dpf和6到8 dpf，通过表型和基因型鉴定。此外，外源性摄食不能挽救atg7-/-或beclin1-/-斑马鱼的生命，因为它们分别在6-15dpf和6-9dpf开始死亡。由于atg7Δ5和atg7Δ2对蛋白质结构域和存活率具有几乎相同的敲除效应，因此在我们的进一步研究中，以atg7Δ5作为atg7敲除模型的实例。

图2. 在仔鱼到幼鱼的过渡过程中atg7和beclin1的突变导致了致死性。

为了研究自噬是否参与卵黄过渡状态，在野生型斑马鱼幼虫的5 dpf和8 dpf之间进行了qRT-PCR。自噬相关基因atg7、beclin1、atg5、atg12的mRNA表达在未进食过程中从5dpf逐渐增加到8dpf，并在摄食后开始减少，而自噬受体p62在饥饿过程中逐渐减少，再摄食后恢复。结果表明，野生型胚胎在母体卵黄过渡期诱导自噬。为了进一步验证突变斑马鱼中atg7和beclin1功能的缺失，在饥饿的突变仔鱼的5和7 dpf处进行了qRT-PCR，并在对照组的8 dpf处进行了qRT-PCR，以检测上述自噬相关基因的mRNA表达并与其野生型相比。正如所料，atg7和beclin1缺失仔鱼分别表现出atg7和beclin1的基因表达非常低。此外，atg5和atg12基因过渡期的表达在突变体和野生型之间没有显著差异。另一方面，在两个突变体中，在饥饿和进食条件下，过渡期的p62表达均显著增加。我们的结果表明atg7和beclin1对于6-14 dpf左右的仔鱼到幼鱼的过渡是必不可少的。

图3.在仔鱼到幼鱼的过渡期间野生型而非突变体表现出自噬诱导作用。

在饥饿时atg7和beclin1突变体不能激活自噬：为了检测突变体在卵黄转换过程中的自噬诱导作用，在饥饿期间，使用LC3-II和P62监测7 dpf时的自噬通量。与野生型仔鱼肝脏和肠道中较高的LC3-II蛋白积累相反，atg7和beclin1突变体均显示LC3-II表达降低。另一方面，与野生型同胞相比，P62在两个突变体中的表达均升高，尤其是在beclin1中。从westernblot分析中也得到了同样的结果，突变体通过P62的积累和LC3-II的减少表现出自噬信号级联的功能障碍。

图4、斑马鱼突变株在代谢应激期间不能激活自噬。

我们的结果进一步表明atg7和beclin1突变体无法在营养耗竭下激活自噬，也无法预测自噬破坏与GIT代谢紊乱之间的相关性。

在atg7和beclin1缺失胚胎的内源性和外源性进食过渡期显示出胃肠道（GIT）发育缺陷：由于从仔鱼到幼鱼的转变也是从内源性到外源性饮食的转变，因此进行了全套原位杂交以确定atg7和beclin1突变体的早期死亡是由于发育缺陷还是代谢不足引起的。Fabp10a是肝脏脂肪酸动员的标记基因，Vil1是肠上皮细胞的标记基因。在72hpf和5dpf的WT和atg7或beclin1突变体中，当胚胎仍依赖母体营养时，两者均表现出正常的表达模式。在6dpf时卵黄耗竭后，突变株中fabp10a的基因表达与野生型相比显著降低，并且Vil1的表达下调。这些结果提示过渡期肝脏代谢和肠道结构畸形的开始。

图5、Atg7和beclin1在卵黄耗竭后影响胃肠道和附属器官。

为了进一步阐明自噬在胰腺活动中的作用，我们检测了胰腺外分泌活动的try表达和内分泌活动的ins表达。atg7和beclin1功能的丧失并没有直接干扰ins在早期发育中的表达，因为从72hpf到6dpf，在卵黄缺失之前和之后都没有表现出差异。另一方面，try，一种在胰腺外分泌中表达的消化酶基因，在72hpf时与WT相比在突变的atg7和beclin1中表现出较低的信号，在6dpf时表现出更显著的下调。

在卵黄耗竭后，尽管饮食但斑马鱼atg7或beclin1功能丧失导致肠道结构异常：为探讨自噬基因敲除与肠道结构的关系，对饲喂7dpf和14dpf的仔鱼进行了纵切面观察。在7 dpf时，WT幼虫的肠道完全发育，在肠道上皮中有正常的褶皱，可见绒毛。另一方面，突变体的肠上皮细胞似乎紊乱。atg7-/-和beclin1-/-的肠道上皮细胞出现异常，核极性和细胞结构发生改变，导致肠屏障和吸收功能紊乱。atg7突变体表现出异常的绒毛结构、微绒毛萎缩和肠上皮细胞增殖受损，并伴有增生，常导致广泛折叠。

图6、atg7和beclin1的缺失导致胃肠道结构缺陷

斑马鱼肝脏代谢失衡与atg7或beclin1基因敲除有关：通过高碘酸席夫（PAS）检测5 dpf时通过内源性饲喂，7 dpf饥饿（卵黄耗竭）以及从7 dpf至14 dpf外源饲喂，的肝糖原含量。 在5 dpf时，野生型和两个突变株均含有足够量的肝糖原。在7dpf时，与WT不同的是，突变株在过渡期肝糖原逐渐消耗，这表明糖酵解增加。与WT相比，在14dpf内， atg7缺失斑马鱼的肝细胞糖原储备完全消失。有趣的是，atg7-/-肠仍然含有残留的糖原，表明当肝糖原流向肠道时会发生消化不良。

图7、Atg7和beclin1基因敲除对饥饿和摄食引起的肝糖原脂质通量的影响。

雷帕霉素通过卵黄滞留而不是通过自噬诱导增强了突变体的代谢平衡：雷帕霉素的药物治疗引起轻度的全身发育迟缓。在7dpf时，我们试图关注雷帕霉素在这个时间点对代谢和自噬的影响。与野生型相比，atg7和beclin1对照组的突变体显示出不透明的肝脏，而所有处理过的突变株和野生型组均显示卵黄吸收显著延迟。同时，组织学观察证实，所有处理组的GIT生长迟缓，因为几乎未检测到肠，卵黄囊几乎占据了整个腹腔。我们发现雷帕霉素可以减缓突变株的急剧恶化，并通过肝糖原的积累和脂质的排泄增强代谢，类似于野生型。尽管雷帕霉素在atg7和beclin1突变体中建立了代谢平衡状态，并将它们的寿命延长了2-3天，但仍不能拯救突变体，分别死于17 dpf和12 dpf。

图8、雷帕霉素影响存活率并诱导形态学发育延迟。

虽然斑马鱼从仔鱼到幼鱼的过渡过程是复杂的，但我们的研究提供的自噬相关基因的分子证据表明了自噬在斑马鱼发育的转折点中的作用。我们的研究为仔鱼到幼鱼过渡期内在的细胞分解代谢机制提供了分子基础，自噬是判断胚胎发育过程中存活率的重要内源性细胞因子之一。此外，它还可能影响水产养殖中的种群动态。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468550X21000022