刚进实验室的小萌新，总有一种天下风云出我辈的风范，两耳不闻窗外事，一心只想发CNS。

想要实验快速上手，首先要掌握的就是研究策略。

在基因功能研究中常用两种基础策略，功能减弱或缺失，功能增强或获得。

实现基因功能减弱，可以采用RNA干扰（RNAi）技术下调目的基因表达。在RNAi使用中，siRNA或shRNA的设计是关键。长度约为21bp的siRNA与蛋白形成RISC复合物，结合目的基因的mRNA，从而使其降解，达到降低基因表达水平的目的（注意RNAi是作用于mRNA水平）。但需要引起注意的是，如果目的基因在细胞中本体表达就较低的情况下（一般ΔCT＞16），就不适合用RNAi了。

随着CRISPR/Cas9技术的成熟，越来越多的科研人员采用基因敲除的方式实现基因彻底缺失的目的。与RNAi不同的是，基因敲除理论上可作用于基因组上所有的基因片段，并使目的基因的蛋白完全不表达，从而更有利于观察细胞表型的变化，简单来说，就是更容易做出实验结果。

CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi干扰表达，哪种调控方式更好？

没有更好，只有最适合！

1. 两种方法没有绝对的好坏，通常RNAi技术由于操作简便，使用广泛，但CRISPR/Cas9可使基因功能丧失更彻底，因此近些年受到广泛追捧。

2. 某些情况下不适合用RNAi，例如需要改变无法转录的DNA区域，只能用基因敲除。

3. 某些特殊情况，敲除该基因会导致细胞生长缓慢，停滞甚至死亡，这样获得基因敲除细胞株比较困难，因此就需要选择通过RNA干扰的手段实现功能减弱。

对于基因功能增强或获得来说，常用的就是过表达和基因敲入了。

过表达和基因敲入，如何选择？

上调表达使得功能增强通常采用的方法是将目的基因的编码区（CDS）构建到载体中，导入细胞内使目的基因的表达量显著增加。但基因在细胞内本体表达已经很高时，此时再进行过表达的调控，细胞的表型很可能不会发生变化，此外，外源高表达对细胞也是个刺激压力，会产生假阳性和假阴性的结果。

而对于功能获得，则常采用基因敲入的方法，例如引入标记基因序列，便于目的基因的示踪和定位，或引入调控表达元件如增强子，调控目的基因的表达；但由于受到同源重组效率和插入基因片段大小的影响，目前细胞基因敲入存在较高的技术难度，普通实验室难以开展。

掌握了研究策略要进行细胞水平功能性验证，貌似很简单。但开展实验后发现好像并不是那么回事。即便按照流程仔细做，实验数据也跟闹着玩似的，一次一个样，数据五花八门，说起来都是泪。

实验虐我千百遍，问题太多该找谁？

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