许多人类疾病的发生与基因突变直接相关，研究表明，有超过15000基因突变与肿瘤、代谢、神经和心血管等疾病发生有关。另外，目前已报道的罕见病（也称孤儿病）超过7,000多种，且有超过80%与基因突变密切相关。遗传性罕见病已经影响到超过3.5亿人群，且多为儿童(～50%)。这类疾病通常严重、临床诊断与治疗多复杂、且多呈慢性发展。目前绝大多数遗传罕见病（～95%）仍无有效治疗方法。另外，与传统药物研发投入比较，遗传性罕见疾病药物研发投入相对较少。因此，针对遗传性疾病治疗方法及药物研发已成为当前科学家们与生物制药行业积极关注的研究领域。然而，由于这类遗传性罕见病的患者人数少，不利于药物（孤儿药）研发的临床试验研究开展，也成为此类药物研发面临的特殊挑战。

小鼠模型在模式生物中所具有的独特综合优势，不仅表现在遗传学与生理学上与人具有相似性，也有其成本低、繁殖饲养快速方便、遗传背景明确、以及相应基因编辑技术成熟等有利因素，使其成为生物医药领域研究，包括基因功能及致病过程、建立人相关疾病模型和药物临床前评价研究等最为重要的模式动物。通过小鼠疾病模型的构建，有助于我们深入揭示潜在致病基因作用机制，为药物临床前评价研究提供工具，成为由药物研发基础研究向临床疾病治疗应用有效转化的重要桥梁。

小鼠疾病模型有助于遗传性疾病致病基因的发现与验证

在此，借用周斌教授2020年发表的成功研究案例，简要说明小鼠疾病模型应用于转化医学研究中的思路与策略，该研究从临床患者中筛选到潜在的致病基因，通过相应基因编辑技术，构建能与人相关疾病病理表型关联的小鼠疾病模型，并将其与人疾病病理症状特征与相关基因联系起来，达到验证与揭示潜在致病基因在诱发疾病表型过程的作用机制。

作者首先从家族性高胆固醇血糖临床患者人群中，筛查到低密度脂蛋白受体（LDLR）未知新突变E207X，且体外细胞实验证实，表达突变LDLR基因与其功能改变具有相关性。为了进一步在体内证实该LDLR基因突变与高胆固醇血症/动物粥样硬化的因果关系，赛业生物应用CRISPR/Cas9基本编辑技术，为作者专门定制了Ldlr-E208X（对应人LDLR-E207X）点突变小鼠模型。研究结果表明，该Ldlr-E208X点突变小鼠模型在高脂饮食诱导下，表现与临床患者相似的高胆固醇血症及动脉粥样硬化表型，从而建立了模拟家族性人胆固醇血症及动脉粥样硬化患者的小鼠疾病模型，为进一步探索该疾病基因疗法的临床前评价研究提供了可能。

作者在Ldlr-E208X点突变小鼠疾病模型基础上，验证基因编辑修正疗法治疗该疾病的可能性与效果。通过将构建的AAV8载体介导CRISPR/Cas9编辑基因治疗技术注射到突变小鼠肝脏，观察小鼠体内正常Ldlr蛋白表达水平及其相关表型变化，结果表明，Ldlr蛋白表达不仅获得一定程度恢复，且其原有的高胆固醇血症及动脉粥样硬化表型，也都获得一定程度的改善。

小鼠疾病模型研究也是人相关疾病药物研发的起点

早期阶段科学假说与疾病潜在药物治疗效果评价，始于小鼠疾病模型构建及其实验室研究。CRISPR编辑技术的诞生与发展，使得构建基因编辑小鼠疾病模型模拟人相关疾病更加简便有效。小鼠疾病模型在研究遗传性相关疾病，比如脊髓性肌萎缩症（SMA）、遗传性视网膜疾病（IRD）、阿尓滋海默症（AD）致病机制与潜在药物的临床前研发中发挥了积极的促进作用。

2019年，由诺华研发的治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）婴儿患者的基因疗法（Zolgensma），获美国FDA批准上市。该药成为首款获批上市的一次性基因治疗方案（定价212.5万美元），也是目前最贵的一个基因替代治疗的突破性疗法，因而具有里程碑意义。

应用SMN基因敲除小鼠，研究SMA早期基因治疗效果表明，对SMN敲除小鼠出生后一天，进行scAAV9-SMN基因治疗，可明显改善SMA小鼠神经肌肉生理学、运动功能障碍及存活时间。而对出生后5天和10天后小鼠进行相同注射治疗，效果则随之明显下降。提示基因治疗时间的早晚与其治疗效果密切相关。

眼睛被公认为是基因治疗的理想靶器官

(1) 眼睛有紧密血视网膜屏障(BRB)，使视网膜成为相对免疫特权组织。对于外来抗原(比如病毒载体)具有耐受性，不会引起严重免疫炎症反应；

(2) 眼睛局部注射病毒载体，引起病毒广泛扩散风险也很低，降低了可能出现的全身副反应发生；

(3) 眼睛器官组织小，需要病毒载体量也相对少，降低了潜在毒副作用；

(4) 眼睛部位手术相对容易操作，便于实施玻璃体内和视网膜下注射病毒载体，达到治疗靶区域；

(5) 视网膜细胞为分化和非分裂细胞，即使用非整合载体（比如AAV），也不用担心转基因的丢失；

(6) 用非侵入方法，可较易检测基因治疗后，视力功能及视网膜结构等变化；

(7) 典型遗传性视网膜疾病为双侧对称性变性，易于设置治疗对照。

先天性黑矇（LCA）是基因治疗眼科疾病的理想选择

相对与光感（PR）细胞而言，RPE65基因表达位于视网膜色素上皮细胞（RPE）层，因而更加便于AAV载体发挥其有效作用。另外，RPE65基因缺失导致的严重视力减退过程，发生于20～30年间，并维持相对保守的视网膜结构变化。这也为基因治疗发挥其恢复视力功能提供了较好机会。2017年，美国FDA批准了Spark公司AAV-RPE65基因疗法（Luxturna），达到恢复与改善先天性黑矇（LCA）患者视力作用。该疗法售价高达75万美元/一只眼(150万/患者)。

通过构建Rpe65基因敲除小鼠模型，建立先天性黑矇(LCA)小鼠疾病模型的研究发现，小鼠视锥光传导特异性相关基因表达显著降低，引起小鼠早期视锥细胞损失，使光感细胞平衡状态破坏，导致视网膜细胞死亡。注射9-或11-顺式视黄醛至2周龄Rpe65敲除小鼠，可增加该小鼠注射区域视锥细胞数密度2倍。提示缺乏顺式视黄醛可能参与早期视锥细胞衰退变性过程。

针对遗传性疾病基因治疗的主要策略

1. DNA基因替代/增加疗法：导入新基因取代突变基因。但对于显性突变情况，抑制突变基因活性，则是需要首先考虑的治疗策略。

2. CRISPR/Cas9基因编辑疗法：两种治疗策略，包括直接在体内修改突变基因，或者通过体外修改患者来源的相关细胞，再回输编辑后细胞至治疗部位保护。主要的挑战：如何增加非分裂细胞基因组重组修复效率，因为此类细胞多缺乏HDR机制。

3. RNA基因治疗方法：不需要将基因传送至细胞核，大大降低基因整合至宿主基因组风险的优势。治疗策略包括RNA剪切修饰、转录后基因剪切和RNA编辑等。主要挑战：降低mRNA传送过程可能引起的免疫原性，以及提高其稳定性。

重组AAV病毒载体

基因治疗的发展给罕见病的治疗带来了希望。不过真正在人身上的治疗开始之前，需要有大量的临床前科研工作为其奠定基础。其中就包括了载体的选择，治疗策略的确定等。目前如果是体内的基因治疗，腺相关病毒无疑占据着统治地位。重组AAV病毒载体则是目前基因治疗最为常用的病毒载体。

优点：通常不会引起明显的免疫反应，也不会融入到宿主基因组，能够在启动子的控制下表达。

缺点：因为不整合到细胞DNA中，当细胞分裂时，就会丢失。

AAV载体包括两种类型：单链AAV (ssAAV)和自我互补AAV (scAAV)载体。当细胞被ssAAV传导后，单链病毒DNA需要先转化为双链形式，这是限速步骤，成为不利因素。scAAV载体病毒感染细胞后，立即以自我互补方式，形成双链DNA，加速病毒复制及基因表达过程，提升了效率。但scAAV载体包装容量只是ssAAV载体的一半(～2.4kb) 。到目前为止，已经在人和灵长类动物中发现与鉴定有超过12个（约100个变异体）AAV载体。其中血清型2、5、7、8和9为目前较为常用的AAV病毒载体。

下期内容预告：中篇我们将讲述小鼠疾病模型在药物临床前评价研究中面临的挑战，敬请期待~

赛业生物一站式服务平台助力基因治疗研究

作为一家基于模式动物的国际化创新性CRO平台，赛业生物深知罕见病是全人类共同面临的公共健康问题，并希望通过自己在专业领域的技术专长助力罕见病基因治疗研究。为此，赛业生物启动了“罕见病基因解码计划”，致力于完善罕见病致病基因数据，结合赛业生物强大的生物大数据分析平台及一站式小鼠模型服务平台和全球客户共同开发罕见病模型，支持罕见疾病药物研发。

赛业生物过去十年来，已为数百课题组提供了数百种用以验证基因治疗疗法的基因编辑模式动物和病毒包装服务。赛业产品和服务引用文献总数超5200篇，其中不乏Nature、Cell、Science等顶级期刊。

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