目的    构建 Sirt3 基因 RNA 干扰慢病毒载体,建立 Sirt3 基因稳定干扰的人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y 细胞株。

方法    从Genbank中检索到Sirt3基因序列,根据此序列设计 Sirt3 基因的 4 条 siRNA干序列和1条阴性对照序列,将它们分别与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的线性化慢病毒载体连接,获得4种重组慢病毒质粒。 将4种重组的干扰病毒质粒分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,测定病毒滴度。 将4种构建的慢病毒 载体感染SH-SY5Y细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测Sirt3的沉默效果,筛选出最有效干扰Sirt3基因表达组。

结果    测序证实成功构建了4种Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,病毒滴度分别为:LV-SIRT3-RNAi-1 8× 108 TU/ mL、LV-SIRT3-RNAi-2 3×108 TU/ mL、LV-SIRT3-RNAi-3 8×108 TU/ mL、LV-SIRT3-RNAi-4 8×108 TU/ mL。 与空白对照组(CON)和阴性对照组(NC) 相比,LV-Sirt3-RNAi-3 组 mRNA 表达水平及蛋白表达水平显著下降(P<0.001, P<0.001)。

结论    成功构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,并筛选出最佳干扰序列组,获得稳定沉默Sirt3表达的SH-SY5Y细胞株,为后续研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用奠定了基础。

阅读原文：Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体及稳定表达的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株的构建.pdf