斑马鱼实验模型：眼毒性筛查

摘要：将对比敏感试验应用于斑马鱼视觉运动反应（OMR）实验，研究对比视觉运动反应（C-OMR）实验探索视觉功能的新模型的有效性。用0（对照），5、10或15μM庆大霉素和地高辛处理受精后（dpf）4天的斑马鱼仔鱼24小时。用C-OMR法对斑马鱼仔鱼进行评估，在5 dpf时用灰白条纹进行分级对比，结果以完成30 s游泳的仔鱼百分比表示（每组n=20）。相同的C-OMR试验用不同的仔鱼重复四次。与对照组相比，用5、10和15μM庆大霉素以及10和15μM地高辛处理的仔鱼在30 s内完成游泳的仔鱼百分比显著降低。C-OMR分析可根据庆大霉素和地高辛的浓度（5、10和15μM）来区分视觉功能的下降是不同的，而单对比灰白条纹的OMR试验则不能。使用分级的对比灰白色条纹分析斑马鱼OMR的方法比单独使用OMR分析更灵敏，有助于评价药物毒性和眼部疾病，提高临床对药物眼部副作用的认识。

关键词：斑马鱼  试验模型 眼毒性 视觉功能

简介：眼睛是一个器官，会受到各种高剂量药物和化学物质的毒性和副作用的影响。特别是药物引起的眼毒性一旦发生就很难控制，是药物开发的重要因素。世界上注册的化学物质超过80,000种，数千种新的化学物质被用作食品，药品和化妆品的原料。因此，对于快速和准确评估化学毒性的新方法的需求不断增长。

斑马鱼被用来鉴别各种药物和化学物质对各种器官的潜在毒性和安全性。通过测量斑马鱼对白色、黑色或灰色视觉刺激的视运动反应（OMR），可以识别药物暴露后的视觉功能和眼毒性。斑马鱼仔鱼的视敏度可以在受精后3天（dpf）进行测量，因为它们此时可以游泳。对比敏感度试验是评价视觉功能的一种方法，用于测量在一定空间频率下区分相邻物体亮度变化的能力，可用于检测多种疾病。因此，我们假设将对比敏感度测试应用于OMR分析将比单独执行OMR分析更准确地评估斑马鱼的视觉功能。在这项研究中，我们开发了一种对比-OMR（C-OMR）分析，该方法将逐步对比敏感度测试应用于OMR分析，以更详细地分析斑马鱼的视觉功能。我们试图调查C-OMR分析是否可以提供有关视觉功能异常的其他信息，而传统单位OMR测试无法检测到这些信息。

动物：本研究使用野生型AB和tg（gfap：EGFP）斑马鱼。所有仔鱼均在28±1°C的胚胎培养基中饲养，并随机分为8组：对照1，5μM庆大霉素组，10μM庆大霉素组，15μM庆大霉素组；对照2，5μM地高辛组，10μM地高辛组和15 μM地高辛组。

药物暴露和研究组：4 dpf斑马鱼仔鱼在含不同浓度庆大霉素或地高辛的胚胎培养基中培养24h。用胚胎培养基（EM）制备庆大霉素，地高辛用0.1%v/v二甲亚砜/EM溶剂溶解，浓度分别为5、10和15μM。对照组用0.1%DMSO处理24h。同样，各治疗组在同一天接触每种药物24小时。

对比视觉运动反应分析的刺激视频：为了制作C-OMR分析的刺激视频，在颜色类别中选择了G4，G7，G8，G9，G10，G11，G12和G13等级的灰色，其中白色和黑色之间的颜色被分为16级。灰白色条纹设计为以2.6个循环/秒的速度在一个方向上通过30 s。 用白色和G4灰色制成的眼刺激条纹将斑马鱼仔鱼移动到起点，然后在相反的方向上依次应用由白色和渐变灰色（从G7到G13）制成的眼刺激条纹， 将斑马鱼的仔鱼移至终点。也就是说，按照 G4← G7→ G4← G8→ G4← G9→ G4← G10→ G4← G11→ G4← G12→ G4← G13→的顺序，分别播放眼刺激准备（G4）和评价（G7、8、9、10、11、12和13）视频30s。眼睛刺激视频之间的时间间隔为1 s。 尤其是，通过在相反方向播放视频来分析斑马鱼仔鱼的响应，以最大程度地减小地理方向对斑马鱼仔鱼OMR的影响。

对比视觉运动反应试验：在斑马鱼仔鱼C-OMR检测中，用透明亚克力制作了由6条泳道组成的游泳托盘，引导斑马鱼游泳。将该游泳托盘放在平板电脑上，播放用于C-OMR分析的刺激视频，以考虑斑马鱼的仔鱼反应。仔鱼的运动因使用的刺激视频而异，并且使用放置在模板上的视频记录器记录了运动。在受精后5天比较各组间的大体形态后，在C-OMR分析之前，对斑马鱼的仔鱼进行黑暗适应（在暗室中）45分钟。在C-OMR分析过程中，以1 s的间隔计数起点和到达点的数量。C-OMR测定结果表示为起点的仔鱼比率随时间的变化、起点仔鱼比率曲线下面积（AUC）和完成游泳的仔鱼百分比。完成游泳的仔鱼百分比是指从起点到终点30秒完成游泳的仔鱼数占仔鱼总数的百分比。相同的实验用不同的仔鱼进行四次不同的C-OMR测定，结果是四次实验的平均值。暴露于药物后，每组收集8只斑马鱼仔鱼进行组织染色。

结果：对照1组和庆大霉素组未观察到大体形态学改变。对照组1，5μM庆大霉素组，10μM庆大霉素组和15μM庆大霉素组中，起点处的仔鱼比例随着时间的推移而下降，并且斜率趋于随着对比度敏感度的降低而降低（从G7到G12）。仔鱼比率在起始点的下降速度较快，且呈浓度依赖性，，顺序为对照组1>5μM庆大霉素组>10μM庆大霉素组>15μM庆大霉素组。

图1、仔鱼在起点曲线上的比率(A)，起点曲线上的仔鱼比例曲线下面积（AUC）（B），在4 dpf暴露于0（对照），5、10和15μM庆大霉素24小时后，根据对比运动反应分析，完成游泳（C）的仔鱼百分比（C）。在G8对比敏感度,对照组1的起点曲线上的仔鱼比率的AUC显著小于5μM庆大霉素组; 在G8、G10、G11、G12对比敏感度,对照组1的起点曲线上的仔鱼比率的AUC显著小于10μM庆大霉素组;在G7、G8、G10、G11、G12和G13对比敏感度，对照组1的起点曲线上的仔鱼比率的AUC显著小于15μM庆大霉素组。在G11和G12的对比敏感度, 5μM庆大霉素组AUC小于15μM庆大霉素组。完成游泳的仔鱼的平均百分比随着对比敏感度的降低而下降（从G7到G13）。在G7，G8，G10，G11，G12和G13的对比敏感度中，完成游泳的仔鱼平均百分数的差异取决于庆大霉素的浓度。

在地高辛毒性实验中，各组之间未观察到总体形态上的差异。在对照组2和地高辛组中，起点时仔鱼的比例随时间降低。对照组2和5μM地高辛的仔鱼率在起始点的下降率相似。另一方面，10μM地高辛和15μM地高辛组开始时仔鱼比例下降的速度要慢于对照组2和5μM地高辛组。

对照组2和5μM地高辛组之间，起点曲线上的仔鱼比例和随时间变化的仔鱼百分比的AUC没有明显差异。在大多数对比敏感度（从G7到G12）中，对照组2和5μM地高辛组的AUC显著小于10μM地高辛和15μM地高辛组的AUC。对照组2和5μM地高辛组中完成游泳的仔鱼百分比显著高于10μM地高辛和15μM地高辛组。 在G11对比敏感度中，10μM地高辛组完成游泳的仔鱼百分比显著高于15μM地高辛组。

在庆大霉素毒性评估实验中，各组之间的平均眼部面积无显著差异。同样，在地高辛毒性评估中也没有发现显著差异。此外，在庆大霉素毒性评估和地高辛毒性评估的实验中，各组间的平均神经节细胞计数没有差异。

本研究检测了暴露于庆大霉素和地高辛后斑马鱼仔鱼对灰白条纹分级对比（C-OMR）的行为反应，以评估每种药物引起的视觉功能变化。

这项研究的结果表明，随着庆大霉素和地高辛浓度的增加以及白灰色条纹的对比度降低，起点时仔鱼数量减少的速度减慢了。此外，每个具有不同对比度的灰白色条纹（G7，G8，G9，G10，G11，G12和G13）的OMR分析均提供了有关视觉功能变化的补充信息，而这些信息可能会被单个OMR测试遗漏。如果在本研究中使用一条对比灰白条纹（G7或G9）进行OMR试验，统计分析不会显示各组之间存在任何差异，或者仅在15μM庆大霉素和15μM地高辛组中会显示视觉功能受到损害。相反，C-OMR分析可以说明庆大霉素和/或地高辛浓度对视觉功能损害程度的影响。

C-OMR分析的一个局限性是，当伴有肌肉骨骼和/或神经系统疾病时，不能正确评估视觉功能。因此，在先前的研究中，C-OMR分析评估导致视觉功能损害而非肌肉骨骼和/或神经系统疾病的药物。通过大体形态和对触觉刺激的正常游泳反应比较，用10μM庆大霉素和10μM地高辛治疗3至5 dpf的斑马鱼仔鱼两天，不会引起肌肉骨骼和运动行为异常。在这项研究中使用的药物浓度为5至10 μM庆大霉素和/或地高辛，持续4 dpf至5 dpf，低于前一研究的浓度。 同样，在本研究的任何研究组中均未观察到总体形态变化。庆大霉素是一种常用的氨基糖苷类抗生素，可引起多种副作用。玻璃体腔注射庆大霉素可引起黄斑梗塞和出血闭塞性视网膜血管炎。以往的研究表明，兔视网膜色素上皮中溶酶体细胞的异常沉积是庆大霉素引起视网膜毒性的最早表现。在我们的研究中，庆大霉素组之间的Müller胶质细胞计数没有变化。 这些差异可能是由于研究之间使用的药物给药途径不同所致。斑马鱼在3 dpf时已经形成了血视网膜屏障，虽然以前的研究已经通过将庆大霉素和其他药物添加到3dpf的胚胎培养基中来评价它们的眼毒性。地高辛用于治疗各种心脏功能障碍，其作用机制是抑制心肌钠-钾ATP酶。地高辛还抑制光感受器中的钠-钾ATP酶，并可能导致视网膜功能受损，如色觉缺陷。在这项研究中，尽管地高辛暴露时间短，但与对照组2相比，C-OMR分析显示地高辛10和15μM组的反应显著降低。 因此，这些结果表明，与OMR法相比，在斑马鱼中使用C-OMR法更能详细地测量药物暴露后的视觉功能变化。

利用视动反应（OKR）通过空间和频率评价斑马鱼幼鱼的对比敏感度的研究表明，利用对比刺激的OKR试验是一种有效的量化眼行为表现的检测方法。但是，与OMR分析相比，OKR测试需要更多的时间和精力，因为要进行此类OKR测试，必须固定斑马鱼仔鱼，并且必须根据旋转的鼓来评估眼睛的运动。因此，本研究建立了C-OMR分析方法，用梯度对比灰白条纹来评价斑马鱼幼鱼的视觉行为，并证明行为实验有助于在更大范围内快速详细描述斑马鱼的视觉功能。

这项研究有一些局限性。首先，本研究没有进行额外的实验来评估药物暴露后的细胞功能状态。第二，本研究没有评估视杆感光器的状态，尽管本研究中开发的C-OMR分析基于与视杆的活性有关的对比敏感度。然而，本研究的主要目的是比较C-OMR法与OMR法在斑马鱼视觉功能评价中的效果。因此，我们研究了斑马鱼暴露于庆大霉素和/或地高辛24小时后的视觉功能，众所周知，庆大霉素和/或地高辛具有眼毒性。

结论：C-OMR分析可能有助于评估药物毒性损伤斑马鱼和相关突变和疾病斑马鱼的眼视觉功能。

原文出自：Development of an experimental model for ocular toxicity screening in Zebrafish - ScienceDirect