小鼠疾病模型在药物临床前评价研究中面临的挑战？

小鼠疾病模型在转化医学研究中已发挥了极其重要的作用，无论是致病基因功能还是新药研发的临床前评价研究等方面。然而，关于小鼠疾病模型应用于药物临床前评价研究预测有效性的问题，也一直是科学家及生物医药企业十分关注与思考的问题。已有的经验教训表明，如何构建小鼠疾病模型，以及如何从已有的模型中选择合理的小鼠疾病模型等，都会直接影响到药物临床前评价研究结果的转化效率。比如，由于肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠疾病模型的错误选择，导致大多数临床前验证实验通过的药物，到了临床试验阶段，却以失败告终。

ALS也叫运动神经元病(MND), 影响中枢神经系统上下运动神经。ALS患者出现扩张性肌肉消耗和萎缩，导致瘫痪，疾病出现后3-5年死亡。ALS分为家族性(fALS,10%) 和散发性(sALS, 90%)。目前已经报道约50多个基因突变与ALS相关，但病理性突变相关致病基因多集中在SOD1, C9ORF72, FUS和TDP-43。

ALS小鼠疾病模型的构建为深入探索与揭示ALS病理学机制，以及开展药物临床前评价研究等，发挥了重要作用。比如，最早的SOD1基因突变转基因小鼠疾病模型，为ALS的早期研究铺平了道路。1993年，SOD1作为第一个ALS致病相关基因被发现，该基因突变占家族性ALS∼20% 、散发性ALS∼2%, 且该基因编码区域突变数超过150个，可以引起显性毒性作用。目前已成功构建了超过20多种啮齿类动物模型，多为人SOD1基因突变体的随机过表达小鼠模型，而SOD1基因敲除小鼠模型却未见任何表型。

人SOD1G93A点突变转基因小鼠，是最早、且应用最多的ALS小鼠疾病模型，用于约97%的ALS药物临床前评价实验研究。其次为SOD1G37R突变小鼠。应用人SOD1基因启动子及调控序列，表达人SOD1基因G93A突变体，构建不同人源化SOD1突变体转基因小鼠模型。研究表明，有SOD1G93A突变小鼠含有25个拷贝的人SOD1G93A突变体，比内源性小鼠SOD1基因的表达量高约13倍。初步的研究发现，不同的人SOD1基因突变转基因小鼠，虽然在疾病症状出现时间与严重程度等方面表现不同，但都会出现不同程度与人ALS疾病相似的进行性运动神经元疾病表型。

然而，进一步深入研究这些所谓小鼠ALS疾病模型发现，大多数人SOD1G93A突变转基因小鼠，并未出现人ALS疾病患者中非常重要的病理特征，即出现大量脑皮层运动神经元退行性变化。因此，有人认为，作为人运动神经元疾病特征的研究工具，SOD1G93A突变小鼠疾病模型本有其先天不足。

另外，更为有趣的发现是，如果在小鼠体内过表达人野生型SOD1基因，也能诱发小鼠一定程度的神经元损伤表型，说明SOD1蛋白过度表达聚集，具有毒性作用。有人提出，与过度蛋白聚集的毒性假设一致，疾病发生严重程度与外源基因拷贝数增加（不管是突变体还是野生体）密切相关。因此，有理由怀疑，应用SOD1突变小鼠疾病模型，虽然可能对ALS致病机制研究有所帮助，但如果开展药物临床前评价研究，可能难以发挥其临床有效转化的作用。过去在针对ALS疾病的药物临床试验中，除了一个药物（riluzole）表现有中等程度延缓疾病发生作用外，其他潜在药物均在临床试验中遭遇失败，也许就是个很好的证明。

关于家族型与散发型ALS表型及病理机制的问题。SOD1突变较少存在于散发型ALS患者中，但散发型ALS表型与家族型ALS相似，有研究者认为，这两种类型ALS可能具有共同的神经退行性通路。所以，研究家族型ALS有助于深入了解散发型ALS病理机制。但也有研究者持不同观点，认为SOD1突变小鼠模型可能只反映家族型ALS患者表型，而不是那些散发型ALS患者，或者98%的非家族型ALS患者基因突变现象。

ALS研究的新发现，即突变TDP-43蛋白引起异常RNA加工过程。TDP-43蛋白为TARDBP基因编码，是DNA/RNA结合蛋白。已发现超过48个TARBDP基因变异体与ALS疾病相关。研究表明，虽然TDP-43突变只占家族性ALS患者3%，但运动神经元内的高磷酸化突变截短蛋白聚集和/或泛素化TDP-43，却参与了超过95%ALS患者脑部与脊髓神经衰退性变化。由于TDP-43蛋白具有RNA加工、传递和剪切等功能，目前认为，TDP-43突变与大多数ALS疾病的发生相关。关于TDP-43致病理论依据是，该突变蛋白与一些相关RNA结合后，通过蛋白增加毒性功能机制，改变这些RNA在细胞质内的代谢过程。该基因如果在细胞核内被去除，则是通过蛋白缺失功能机制，引起相似的RNA代谢改变。所以，TDP-43平衡状态是维持正常细胞功能的关键因素。该蛋白过表达和缺失均可成为ALS疾病的致病原因。

TDP-43纯合全身敲除小鼠出现胚胎致死表型 ，杂合子敲除小鼠可存活，但老年小鼠出现运动障碍迹象。为了探索TDP-43蛋白在中枢神经系统及ALS作用机制，有研究者利用朊病毒启动子（PrP) 表达A315T突变体或野生体TDP-43蛋白，构建神经系统表达的转基因小鼠。该研究表明，Prp-TDP43A315T转基因小鼠出现进行性致命神经退行性疾病。虽然突变基因在整个神经系统表达，但泛素化蛋白沉积的病理学变化集中在特殊神经元细胞，包括额叶皮层锥体与脊髓运动神经元，但却未见细胞浆TDP-43聚集。提示DNA/RNA结合蛋白功能改变，而不是毒物聚集，导致了神经退行性变化。

然而，后来的进一步研究发现，TDP-43A315T小鼠模型并未表现令人信服的ALS样肌肉神经功能缺陷表型，而突变小鼠早期死亡与胃肠(GI)功能损伤有关。表现为进行性胃肠蠕动性降低，最终导致GI运动停止。所以，目前认为，TDP-43A315T突变小鼠疾病模型可能适合研究胃肠道神经退行性表型，但并不适合ALS疾病的药物临床前评价验证研究。

如何构建与选择理想合理的小鼠疾病模型？

ALS小鼠疾病模型用于药物临床前评价研究转化效率低的经验教训，也让我们思考一个非常重要的问题，即如何构建与选择合理且理想的小鼠疾病模型，以提升其在药物研发研究中的临床转化价值与预测性。过去的失败经验已经告诉我们，如果选用了不适合或不准确的小鼠疾病模型，或小鼠体内实验设计不合理等，由此获得的临床前实验结果预测价值，则会大大降低。

让我们以ALS小鼠疾病模型研究相关实际案例，进行进一步深入的解析。回顾分析ALS小鼠疾病构建历程，即从起初的SOD1突变转基因小鼠，到后来新的TDP43突变小鼠疾病模型的发展过程。现在已经清楚，SOD1突变小鼠疾病模型并不能完全模拟人ALS疾病的所有特征，特别是缺乏该疾病诊断的典型特征，即SOD1患者大脑皮层运动神经元衰退与损失表型，显示了小鼠与人在运动皮层神经退行性病变方面的差异。还必须清楚一点的是，实际上，此类SOD1突变体转基因疾病模型的建立，需要依赖该突变基因较高水平的过表达，才能诱发ALS疾病发生。而且，野生型人SOD1基因过表达，也可以诱发小鼠相应的神经退行性改变。因此，有理由认为，过表达SOD1基因本身，足以诱发该疾病常见表型。

临床上有超过50%ALS患者，同时伴有额颞叶痴呆（FTLD），而SOD1突变小鼠则未见此表型。提示人与小鼠SOD1致病过程可能存在不同致病通路。所以，由该SOD1小鼠疾病模型研究获得的转化预测价值，也就可想而知了。另外，与其他ALS致病基因比较，SOD1基因本身，并不具备其独特ALS疾病表型，因此，在不同ALS疾病相关基因下游，有可能存在共享的致病通路。

PrP-TDP-43-A315T人突变小鼠是最早构建的TDP-43转基因小鼠模型，该转基因小鼠在3个月后，出现体重下降与行为相关等表型，并在153天左右开始死亡。起初的研究表明，约20%脊髓运动神经元损失，到约50%的皮层脊髓束轴突损失的发展过程。也有研究分别构建了人突变PrP-TDP-43-A315T和人野生型PrP-TDP-43转基因小鼠模型，且均有超过4倍表达量增加。这些TDP-43转基因小鼠都表现有存活时间缩短表型，且存活期长短与突变基因拷贝数负相关。而所有野生型TDP-43转基因小鼠，却未见早期死亡现象。

然而，值得注意的是，在仔细分析该研究后发现，其实研究中构建的两个过表达转基因小鼠模型（突变与野生型），TDP-43基因的表达量是有一定差异的，即野生TDP-43基因表达量较突变TDP-43基因表达略低，所以，以前研究中观察到TDP-43突变小鼠与野生型小鼠的某些表型差异现象，可能是因为转基因表达量差异所致。而且，如此的分析推论也得到另一个实验研究结果的间接证实，该研究分别通过比较突变TDP-43-M334V和野生型TDP-43两种转基因小鼠模型发现，两种小鼠（突变与野生型）基因表达量相似（均为～3倍增加），且未见两种小鼠在疾病发生严重程度方面有差异。提示TDP-43基因表达水平的改变，而不是基因突变特征本身，是诱发小鼠疾病表型的原因。并且，对TDP-43突变小鼠进一步分析研究也发现，该转基因小鼠死亡表型，并非由运动神经元功能损伤，导致运动神经元衰退变化，而是由胃肠道功能破坏所致。

由于转基因小鼠模型构建技术本身的特点，也使该类小鼠疾病模型研究结果的分析与解释，变得更为复杂。因为应用这种转基因小鼠研究中获得的研究结果，是很难将人TDP-43过表达与小鼠内源性tdp-43功能完全区分开来。而且，想要在人TDP-43转基因小鼠中，实现转基因过表达水平控制在接近ALS患者观察到表达水平，也是相当困难。实际上，有一些ALS患者不仅含有突变TDP-43蛋白，同时也见有另外ALS致病基因，比如C9ORF72基因突变同时出现的现象，而作为ALS致病基因C9ORF72，也可能引起运动神经元受损的特殊病理学改变。

ALS小鼠疾病模型构建策略与方法的不同，可直接影响到疾病基因拷贝数及表达量等，从而影响到疾病的表型特征与严重程度。比如，已知SOD1G93A转基因小鼠插入的人突变基因可高达25个拷贝数，表现有快速进行性运动神经元衰退的严重损伤，有研究表明，低拷贝数（～8-10拷贝数）的人SOD1G93A转基因小鼠品系，出现瘫痪症状时间约在24～34周鼠龄时候，明显晚于高拷贝数（～25拷贝数）转基因小鼠。如果突变和野生型SOD1转基因小鼠表达量相似，同样也有相似的神经学相关表型结果，说明小鼠疾病表型，包括早期轻度瘫痪迹象的脊髓空泡化，甚至运动神经元衰退损失等，可能不是因为突变基因引起，而更可能是因为基因的过表达所致。关于首个报道的ALS小鼠疾病模型，即SOD1G93A突变转基因小鼠模型，几乎都没有研究基因插入位点信息。幸运的是，到目前为止，还未见关于SOD1G93A转基因的随机插入，造成对已知基因破坏的报道。

因此，如何构建理想的突变转基因小鼠模型，实现转基因表达水平与小鼠内源性基因表达水平相似，以排除可能因为基因过表达本身引起的非特异性作用，目前的实际操作难度却相当大。因为转基因小鼠构建常常用到外源启动子，确保转基因在特定组织中高表达。而如此异位表达，又可能引起新的非特异性表型。比如，TDP-43A315T转基因小鼠是应用朊病毒启动子（Prp），虽然该启动子具有神经元强活性，但也广泛表达在其他组织细胞类型，可引起小鼠意外早期死亡，而死亡原因是由于肠道神经退行性病变，而非运动神经元损伤所致。

与随机转基因小鼠模型比较，基因定点插入小鼠模型，则具有病程进展较慢，且表型出现也较轻的特点，这可能与研究蛋白表达水平相对较低有关。但基因定点插入小鼠模型保留了基因正确时空表达水平，避免了一些蛋白因为过表达诱发的非特异性毒性作用，有助于在小鼠生命周期内，研究基因/蛋白与其作用靶标分子间的相互作机制。也有关于ALS小鼠疾病模型的基因定点插入的相关研究报道，比如，将含全人TDP-43 BAC（包括基因内含子和调控序列）插入小鼠Roas26位点，建立ALS小鼠疾病模型。该小鼠表现为人TDP-43低水平表达，只有轻度年龄依赖相关的运动功能障碍表型。另外，TDP-43Q331K突变定点插入小鼠模型，表现有TDP-43增加毒性功能, 即该基因出现剪切改变和蛋白自我调控功能障碍，导致额颞叶痴呆出现，虽然该小鼠模型并未表现包含体或者运动神经元损失表型。一般而言，这类定点插入的小鼠疾病模型，出现表型较慢也较轻，因而有利于揭示疾病症状出现的早期特征，有助于寻找早期生物标志物。当然，表型出现较晚，自然增加了相应研究成本。尽管如此，定点插入小鼠疾病模型，为研究疾病发生早期阶段，提供了充裕的研究窗口期。

相反, 转基因小鼠疾病模型，则常引起明显表型和显著运动神经元损失变化，使其成为疾病晚期过程相关研究的潜在选择。应用小鼠Prp启动子构建的TDP-43Q331转基因小鼠模型，不仅表现有运动神经元损失，也出现肌肉退行性改变和伴有运动损伤的神经肌肉结合损伤，但这些表型的出现，都与该基因过表达密切相关，呈现TDP-43表达的明显计量-效应依赖毒性作用。

如何定义好的小鼠疾病模型。首先，必须真正了解研究者感兴趣且需要的小鼠疾病模型，然后，才是寻找最为合适或更好的小鼠模型开展研究，并建议尽量选择不同策略及技术构建的小鼠疾病模型，开展疾病特征研究。比如，针对ALS小鼠疾病模型，需要了解研究目的是为了关注早期微小的脊髓运动神经元的变化？还是揭示上下神经元的损伤死亡？或者研究神经胶质细胞所发挥的作用等？

如何选择合适且理想的小鼠疾病模型。评价与选择是受诸多因素的影响。而关键考虑要素是小鼠疾病模型的设计策略，即小鼠疾病模型是如何设计与构建的，比如，是应用转基因随机过表达策略，还是定点/原位插入策略等。当然，研究者需要仔细分析研究小鼠疾病模型表型特征及其影响因素，期望能与对应人疾病表型特征及影响因素相似，比如，性别、年龄与遗传背景等，因为这些都是影响疾病表型特征的重要因素。总之，合适的小鼠疾病模型需要至少满足以下几点：

1. 能够准确模拟人相关基因特定功能与疾病特征，这是小鼠疾病模型应用于药物临床前评价研究最为重要的基石。

2. 有较高的研究结果出现频率，使其成为可靠科学研究的有力证据支持。

3. 可被重复验证，易被其他研究者使用，促进该研究领域发展进步。

4. 可被广泛应用，小鼠模型适合其他不同动物设施饲养与繁育等。

在选择小鼠疾病模型进行药物临床前研究的时候，建议参照如下步骤进行：

1. 确定研究疾病目的；

2. 了解影响疾病发生的内在与外在因素；

3. 查阅已有的相关小鼠模型综述文献；

4. 收集研究疾病的生物学信息资料；

5. 明确研究疾病的独特资源；

6. 确定小鼠疾病模型的初步选择；

7. 开展小鼠疾病模型初步研究；

8. 分析小鼠疾病模型研究初步结果与生物学信息资料等相关知识间的差距；

9. 评估小鼠疾病模型初步应用研究的有效性；10. 明确小鼠疾病模型的最终选择。

上期内容回顾：上篇—小鼠疾病模型构建与药物临床前评价研究的思考

下期内容预告：下篇我们将讲述影响药物临床前研究结果预测有效性的因素，敬请期待~