斑马鱼：连接蛋白C末端在皮肤斑纹形成中的作用

摘要：斑马鱼的身体呈现出条纹状的皮肤图案。 条纹图案的形成涉及两种连接蛋白，即连接蛋白39.4（Cx39.4）和连接蛋白41.8（Cx41.8）。在此，我们研究了Cx39.4和Cx41.8的C末端（CT）结构域在体内和体外的作用。为了研究CT结构域在体内的作用，我们建立了在色素细胞中表达CT结构域修饰的连接蛋白系列的转基因斑马鱼品系，并观察到鱼的皮肤形态。为了研究CT结构域在体外的作用，我们在Neuro-2a（N2a）细胞中表达了CT结构域修饰的连接蛋白序列，并计算了斑纹的形成频率。cx39.4-/-突变体以及cx39.4和cx41.8双敲除突变体斑马鱼中缺少CT域的Cx39.4的过度表达所产生的皮肤模式类似于全长Cx39.4所产生的皮肤形态。荧光蛋白融合CT结构域修饰的Cx39.4在N2a细胞间形成缝隙连接斑纹。CT截短的Cx41.8的过表达拯救了cx41.8-/-突变体中的突变表型，但在双敲除斑马鱼中不起作用。荧光蛋白融合CT截短的Cx41.8在无Cx39.4的N2a细胞间几乎不形成斑纹，但与Cx39.4共表达时形成缝隙连接斑纹。结论至少在斑马鱼的色素细胞中，Cx39.4的CT结构域对于蛋白质功能不是必需的。 但是，是否需要Cx41.8的CT域取决于Cx39.4的表达。

简介：细胞间的相互作用是生物体发育过程中形态发生和器官发生的关键因素。 为了了解细胞间相互作用的分子基础，已经积极分析了包括膜蛋白和释放因子在内的分子因素。缝隙连接（GJs）是一种介导小分子、离子、代谢物和分子量小于1000的第二信使在连接细胞间直接传递的细胞间通道。在脊索动物中，GJ由连接蛋白亚单位组成。六个连接蛋白齐聚成六聚体结构，称为半通道，半通道与相邻细胞的相应半通道对接形成GJ。因此，GJ由12个连接蛋白亚单位组成。连接蛋白是一种4通道跨膜蛋白；它包括几个域。N末端（NT），细胞内环（IL）和C末端（CT）域位于细胞质中，两个细胞外环（EL1和EL2）位于细胞外。许多研究表明，CT结构域在GJ功能中起着多种作用，包括通过与其他膜蛋白的相互作用将连接蛋白锚定在细胞膜上，连接蛋白定位在细胞膜上，以及在通道门控中的作用。据报道，CT结构域的突变与多种人类疾病有关。异聚体通道在交换分子、蛋白质运输和半通道/gj的电生理特性方面提供多样性。斑马鱼是一种小型热带鱼，因其在分子生物学中的应用而备受关注；斑马鱼胚胎的透明性便于分析，易于繁殖，并且易于利用转座子进行基因转移，使斑马鱼成为研究的优秀模式生物。这种鱼的体表有黑黄色条纹，由三种色素细胞组成：黑色素细胞、黄色素细胞和虹膜色素细胞。这些特性使斑马鱼成为研究细胞自主皮肤模式形成的生物学实验和理论研究的优秀模型。在斑马鱼条纹图的形成过程中，有两种类型的连接蛋白，连接蛋白39.4（Cx39.4）和连接蛋白41.8（Cx41.8）。Cx39.4是一种硬骨鱼类谱系特异性连接蛋白，Cx41.8是哺乳动物Cx40的同源基因。此外，通过转基因实验检测了色素细胞对连接蛋白表达的要求，得出结论：黑色素细胞中cx39.4的表达和黄色素细胞中cx41.8的表达是条带形成的最低要求。cx41.8在黑色素细胞中的表达对稳定的条纹形成具有支持作用。

在这项研究中，我们重点研究了Cx39.4和Cx41.8的CT结构域，并研究了它们在斑马鱼皮肤模式形成中的作用。将CT截短的Cx39.4和Cx41.8引入突变鱼基因组中，并对其功能进行了研究。为了弥补斑马鱼缺乏市售抗体的缺点和进一步研究蛋白质在活体鱼中的定位，本研究设计并使用了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）/红色荧光蛋白（RFP）融合蛋白。EGFP标记的连接蛋白在色素细胞中的功能被证实，以了解它们是否拯救突变表型。

图1.利用CT截短连接蛋白的转基因实验。

Cx39.4和Cx41.8的CT结构域对斑马鱼条纹形成的要求：我们研究了Cx39.4和Cx41.8的CT结构域是否是斑马鱼条纹色素形成所必需的。我们设计了以下CT截短的连接蛋白：Cx39.4–255STOP，去除了256到341位的86个氨基酸残基；Cx41.8–240STOP，去除了241到370位的130个氨基酸残基。Cx41.8中的第240位对应于Cx39.4中的第255位。在每个突变斑马鱼系中表达相应的突变连接蛋白：在cx39.4-/-突变体鱼中表达Cx39.4-255STOP，在cx41.8-/-突变体鱼中表达Cx41.8-240STOP。使用mitfa启动子在黑色素细胞中表达Cx39.4，并使用cx41.8启动子在黑色素细胞和黄色素细胞中表达Cx41.8。我们将Tol2转座酶和每个质粒构建体显微注射到相应的突变系cx39.4-/-或cx41.8-/-中，并获得了F0代。然后将每个F0嵌合体鱼与cx39.4-/-或cx41.8-/-鱼杂交，导致在F1代形成Tg品系。“ Cx39.4–255STOP >> cx39.4-/-”表示在mitfa-启动子的控制下，Cx39.4–255STOP在具有cx39.4-/-背景的鱼类中表达。“ Cx41.8–240STOP >> cx41.8-/-”表示在cx41.8-启动子的控制下，Cx41.8-240-STOP在具有cx41.8-/-背景的鱼类中表达。我们评估了CT截短的连接蛋白是否在F1代的皮肤模式形成中起作用。 出乎意料的是，在F1代的这两种Tg品系中都观察到了条纹状的皮肤图案。换句话说，Cx39.4–255STOP和Cx41.8–240STOP都挽救了cx39.4-/-或cx41.8-/-突变表型，就像全长连接蛋白一样。每个实验中的单个Tg鱼表现出几乎相同的表型。

Cx39.4和Cx41.8的CT结构域在双基因敲除斑马鱼中的作用：我们检查了这些CT截短的连接蛋白是否在WKO突变体中起作用。通过将F0嵌合体鱼与WKO鱼杂交两次，生成了包含Cx39.4–255STOP或Cx41.8–240STOP的WKO品系。将嵌合体鱼（F0）（Cx39.4–255STOP注入的cx39.4-/-突变鱼）与WKO鱼杂交，生成具有cx39.4-/-; cx41.8 +/-遗传背景的鱼（F1 ）。然后，将这些Tg鱼（F1）与WKO鱼杂交，生成具有cx39.4-/-; cx41.8-/-遗传背景（F2）的WKO鱼。在每个步骤进行PCR来确定转基因的整合，并且通过cx39.4和cx41.8测序来确认遗传背景。通过相同的方案，将F0嵌合体鱼（Cx41.8–240STOP注入的cx41.8-/-突变鱼）与WKO鱼杂交，生成cx39.4 +/-; cx41.8-/-鱼（F1）， 然后与WKO鱼杂交。因此，获得了“Cx41.8–240STOP>>WKO”Tg品系（F2）。在Cx41.8的情况下，Cx41.8–240STOP转基因没有改变F2代的WKO突变表型，这就提出了由于实验问题（例如转基因插入位点失活），引起了关于Cx41.8–240STOP蛋白是否该表达但不表达的疑问。根据获得的结果，前一种可能性似乎是正确的。 如上所述，通过将“ Cx41.8–240 >> cx39.4 +/-; cx41.8-/-”（F1）与WKO杂交，生成了Tg鱼“ Cx41.8–240STOP >> WKO”（F2） 鱼。 这些“ Cx41.8–240 >> cx39.4 +/-; cx41.8-/-”（F1）鱼由于Cx41.8–240STOP插入而显示出条纹模式，插入的转基因在此Tg系中表达。通过这个实验，我们得出结论：Cx39.4–255STOP是功能性的；由于Cx39.4-255STOP的作用，WKO表型改变为斑点型，而Cx41.8-240STOP在具有WKO背景的鱼类中不起作用。

结合单、双基因敲除突变系的实验结果，我们发现在斑马鱼皮肤纹样形成过程中，Cx39.4 CT结构域不是必不可少的；但是，是否需要Cx41.8 CT域取决于Cx39.4的存在。 CT截短的Cx41.8需要Cx39.4才能实现其功能，膜定位和/或GJ功能。

Cx39.4和Cx41.8的可视化：我们设计了荧光蛋白标记的Cx39.4和Cx41.8，用于进一步研究蛋白质在培养细胞和活鱼中的定位，以弥补斑马鱼中缺乏市售抗体的缺点。先前研究的结果表明，融合EGFP的全长Cx39.4（Cx39.4EGFP）和Cx41.8（Cx41.8EGFP）在cx39.4-/-或cx41.8-/-突变体中不起作用。最近，我们成功地获得了功能性EGFP标记的Cx39.4，Cx39.4exc256–321EGFP，其中EGFP序列取代了Cx39.4ct结构域第256位到第321位的氨基酸残基。带有EGFP标签的Cx39.4拯救了cx39.4-/-突变表型，并在鱼皮上的黑色素细胞之间和N2a细胞之间形成了GJ斑块。在这项研究中，我们设计了几个EGFP标记的Cx39.4结构，并用它们来检测CT结构域在N2a细胞之间GJ斑块形成中的作用。另外，观察到黑色素细胞之间的GJ斑块形成。

图2、N2a细胞之间的Cx39.4间隙连接重建。

培养细胞间GJs的形成：使用这些质粒构建体，在N2a细胞中瞬时表达了带有EGFP标签的Cx39.4 s和Cx41.8 s。 N2a细胞的内源性连接蛋白水平低，通常用于GJ相关研究。计算显示EGFP信号的细胞对之间的斑块形成频率. 如上所述，EGFP融合的全长Cx39.4和Cx41.8没有形成GJ斑块。Cx39.4 s在CT区域内有EGFP标记，显示GJ斑块形成频率约为20%–40%。关于PDZ结合基序的要求，Cx39.4del256–341EGFP显示的GJ斑块形成频率约为其他Cx39.4构建体的一半或不到一半。这表明PDZ结合基序在Cx39.4功能中起一定作用。

图3、 N2a细胞之间的Cx41.8间隙连接重建

异聚体/异型GJ形成：我们检查了异质和异型条件下的GJ形成。 CT截短的Cx41.8（Cx41.8–240STOP）拯救了突变表型cx41.8-/-。 但是，它在WKO突变体中不起作用。基于此，我们假设Cx39.4可能有助于Cx41.8执行其功能。为了验证这一假设，我们检测了Cx39.4在N2a细胞与Cx41.8的异聚体GJs中形成斑块的能力。我们转染了Cx39.4ins287EGFP和Cx41.8del241–370RFP，并计算了N2a细胞之间异源GJ斑块形成的频率，从而在这两个细胞中均观察到绿色和红色荧光信号。该结果表明，Cx39.4有效地将Cx41.8摄取到细胞膜上。 这与体内转基因结果非常吻合，该结果表明CT截短的Cx41.8，Cx41.8–240STOP需要Cx39.4的表达才能在体内发挥其功能。相反，同质异型GJs的斑块形成频率高于单独的Cx41.8的斑块形成频率。

图4、Cx39.4和Cx41.8形成异型缝隙连接。

原文出自：Role of the Connexin C-terminus in skin pattern formation of Zebrafish - ScienceDirect