斑马鱼早期发育阶段：锑的神经毒性

摘要：越来越多的研究揭示了锑 (Sb)对土壤栖息和水生生物个体的毒性。 然而，对锑的神经毒性作用及其潜在机理知之甚少。本次试验我们研究了锑（0、200、400、600和800 mg/L）对斑马鱼胚胎的神经毒性。锑暴露后，斑马鱼胚胎表现出异常表型，如体长缩短、形态畸形和心脏功能减弱。行为学实验表明，锑对斑马鱼胚胎具有神经毒性，表现为自发运动频率降低、触觉反应延迟、运动距离缩短。我们还发现，锑导致斑马鱼胚胎中乙酰胆碱酯酶 (AChE) 水平降低，以及神经功能标记物（如 gfap、nestin、mbp 和 shha）的表达降低。此外，锑显著提高活性氧水平，显著降低谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。总之，我们的研究结果表明，锑可以通过影响神经递质系统和氧化应激，改变斑马鱼胚胎的发育毒性和神经毒性，从而改变行为。这些结果将增进我们对锑引起的神经毒性、环境问题和健康危害的理解。

关键词：斑马鱼 毒性  行为  AChE  氧化应激

简介：多种化学污染物来自农业和工业，并通过各种渠道进入地表水。这些有毒物质对水生物种构成潜在风险。近几十年来，重金属污染已成为全球性问题。伴随着矿业和制造业的快速发展，锑（Sb）在生态系统中逐渐积累，很容易通过食物链、皮肤接触，甚至呼吸进入人体。锑在自然环境中主要以三价(Sb(III))或五价(Sb(V))氧化态存在，其化合物几乎都对人体有毒。了解它们对生物体的破坏机制，将有助于我们进行针对性的防治。 先前的研究表明，锑及其几乎所有化合物对免疫系统、消化系统和心血管系统都有毒性。锑急性中毒表现为痉挛、呕吐、血尿等，严重者可出现肌肉坏死、肝硬化、肾炎等。慢性中毒潜伏期长，表现为慢性支气管炎、肺气肿，甚至胸膜粘连。然而，虽然有研究简要提到了锑对神经系统的不良影响，表明锑可能与一系列退行性疾病的病理过程有关，但其毒性表型不同，所涉及的分子机制尚无定论。因此，需要更多的研究来揭示锑的神经毒性。斑马鱼是一种已建立的脊椎动物模型，广泛用于研究环境污染物的毒性。具有体积小、维护成本低、繁殖力强、发育快、胚胎和仔鱼光学透明等特点。斑马鱼的大脑在神经解剖学和神经化学途径上与人脑非常相似。斑马鱼和人类之间有许多基因和分子标记是同源的。此外，研究表明，斑马鱼的学习记忆能力、社交焦虑等行为表型与人类相似。因此，斑马鱼为评估环境毒素的神经毒性提供了一个理想的模型。脊椎动物的 GFAP 调控元件已被用于产生在神经元前体中表达 GFP 蛋白的转基因斑马鱼。Tg(gfap:GFP) 斑马鱼在 gfap 基因的神经胶质特异性调控元件的指导下表达 GFP。 Tg(gfap:GFP) 转基因斑马鱼可用于进一步了解神经胶质细胞在中枢神经系统发育中的作用。水生生物不能降解进入它们身体的大部分有毒化合物。本研究旨在探讨锑对斑马鱼早期发育的神经毒性。首先，对斑马鱼胚胎暴露于酒石酸锑钾（PAT）后的运动行为、触觉试验和自由游泳试验进行了评价。接触化学物质会改变动物的行为功能，这些行为变化可以被认为是它们对神经功能影响的一个标志。此外，这些行为变化与乙酰胆碱酯酶 (AChE) 活性降低有关，这可能会引发生理损伤。确定了与神经系统相关的几个标记基因的 AChE 活性水平和转录反应。 AChE在传递神经冲动中必不可少，其活性的变化是评估神经毒性的指标。乙酰胆碱酯酶的抑制影响胆碱能突触的神经传递。正常情况下，ROS的产生和清除处于动态平衡状态，而生物体暴露于重金属下会产生大量的ROS。过量的 ROS 产生会导致细胞稳态失衡，从而导致氧化应激。此外，还检测了氧化损伤指标和抗氧化指标，以揭示锑诱导发育性神经毒性的潜在机制。这项研究可能为锑污染造成的不利影响提供新的证据，并为锑影响斑马鱼神经系统发育的机制提供新的线索。

锑暴露引起的形态畸形和发育毒性：PAT处理组斑马鱼胚胎在不同发育阶段的典型表型如图1A所示。与对照组相比，暴露于 PAT 的胚胎表现出形态畸形，包括心包水肿、脑出血、未膨胀的鱼鳔和弯曲的脊柱。治疗组与对照组在24 hpf的存活率无显著差异。然而，在 48 hpf 时，与对照组相比，200、400、600 和 800 mg/L PAT 治疗组的心率分别显著降低了 29.48%、35.8%、42.3% 和 46.15%。此外， PAT处理组48hpf时的斑马鱼体长随着浓度的增加而略有下降。此外，与对照组相比，暴露于200、400、600和800mg/L PAT后，斑马鱼的畸形率显著增加，分别达到7.123%、11.33%、14.40%和17.80%。结果表明，锑在斑马鱼早期发育阶段影响心脏功能，这可能导致斑马鱼胚胎发育缺陷和表型异常。

图1.PAT诱导的形态异常和发育毒性(A） 正常和代表性形态异常斑马鱼胚胎。白色箭头表示异常。PE：心包水肿，CE：脑出血，USB：未膨胀的鱼鳔，CS：弯曲的脊柱。(B-E) 存活率、心率、体长和畸形率的统计数据。

锑暴露改变了胚胎的自发运动：在胚胎中观察到的第一个运动是尾巴的交替侧向收缩，称为自发运动（图 2A）。 这种运动是由与尾巴相邻的体节中发育的神经元触发的。记录了从19 hpf到27 hpf每小时所有组中的胚胎自发运动频率。虽然统计结果在这个发育阶段呈现出类似的先增加后减少的趋势，但很明显，PAT暴露后胚胎自发运动在这一时期的所有时间点都以浓度依赖的方式受到抑制。尤其是高浓度组（600和800 mg/L）时，胚胎自发运动受到明显抑制。这些结果表明，锑可能导致斑马鱼胚胎神经系统功能障碍。

图 2. 自发运动。 (A) 胚胎自发运动的示意图。 (B) 在 19-27 hpf 时记录尾巴弯曲 1 分钟。

锑暴露抑制了胚胎对触摸的反应：为了研究锑对斑马鱼神经回路的影响，用针刺激每组的幼鱼，在27 hpf和36 hpf时记录反应。对照组幼虫被刺后立即表现出适当的反应，如肌肉收缩或试图逃跑。我们的结果清楚地表明，在两个观察时间点，PAT 治疗组的反应比例均低于对照组。在 27 hpf 时与对照组相比，200、400、600 和 800 mg/L PAT 治疗组的反应百分比分别降低了 12.76%、27.53%、37.29% 和 52.18%。在 36 hpf 时与对照组相比，200、400、600 和 800 mg/L PAT 治疗组的反应百分比分别降低了 10.78%、12.17%、27.29% 和 42.26%。这些结果表明锑导致斑马鱼幼虫的神经回路缺陷。

图3.触摸反应测试(A） 触摸反应测试的示意图。(B-C) 在 27 和 36 hpf 处对触摸尾部反应的统计数据。

锑暴露导致自发运动减少：自发运动受意识调节，具有特定的目的和方向。 它是动物和人类行为的基础。在 120 hpf 下在 PAT 暴露后，对斑马鱼幼虫进行行为监测 20 分钟。正如典型的轨迹所示，对照组的斑马鱼幼虫在靠近培养皿壁的地方游了几圈。PAT治疗组的路径表现出行为紊乱和距离短的特征。统计结果表明，各处理组斑马鱼幼体的自由游动距离均显著短于对照组。这些结果表明锑会导致自发运动的丧失并显著影响神经行为。

图 4. 自发运动测试。（A） 暴露于PAT的斑马鱼幼虫的代表性运动痕迹(B) 暴露于可见光 20 分钟期间的自由运动距离。

锑抑制神经细胞的活力：胶质纤维酸性蛋白 (Gfap) 是一种在中枢神经系统 (CNS)，尤其是星形胶质细胞中广泛表达的中间丝蛋白，它参与许多关键的神经过程。用 48 hpf 的 Tg(gfap:EGFP) 转基因斑马鱼品系检查了初始神经发生。对照组Gfap阳性细胞主要分布于大脑中后部，在相对集中的区域内高表达。然而，暴露于PAT的胚胎中GFP的表达明显降低。

图 5. PAT 损害神经系统的发育和功能。

锑暴露降低了乙酰胆碱酯酶活性：在锑暴露后观察到所有治疗组的 AChE 活性倾向于以 PAT 浓度依赖性方式下降。 特别是，与对照相比，800 mg/L 组的AChE 活性几乎减少了一半。

锑暴露抑制了标记基因的转录：在 48 hpf PAT 治疗后评估发育神经毒性生物标志物的表达。qPCR 分析的结果表明gfap、nestin、shha 和 mbp 的 mRNA 水平倾向于以 PAT 浓度依赖性方式降低。在暴露的最高浓度下，上述基因的转录水平分别显著降低到对照组的28.4%、84.1%、33.4%和45.9%。

锑暴露引起氧化应激：对斑马鱼仔鱼进行体内成像，以研究 72 hpf PAT 暴露后的 ROS 产生。 如每个 PAT 处理组的代表性图像所示，仔鱼的荧光强度显著增加。定量分析表明，在200、400、600和800 mg/L PAT处理组中ROS 分别是对照的1.64、3.53、3.64和4.02倍. 这些结果表明，PAT对斑马鱼仔鱼体内ROS的产生具有剂量依赖性。暴露于 PAT 后，还测量了斑马鱼胚胎中的氧化参数，如 MDA、SOD 和 GSH。结果表明，处理组的 MDA 含量以 PAT 浓度依赖性方式明显增加，分别升高至对照组的 1.16、1.36、1.62 和 2.19 倍。与此相反，PAT处理后斑马鱼仔鱼体内保护性抗氧化酶的活性或含量持续下降。SOD 活性和 GSH 含量的降低与 PAT 暴露浓度成反比。 200、400、600和800 mg/L处理组的SOD活性分别降低至对照组的80.30%、62.12%、36.36%和9.85%。同时，PAT处理组的GSH含量也有类似的下降趋势，与对照组相比，GSH含量分别下降到91.03%、75.86%、52.41%和14.48%。

图 6. PAT 处理后胚胎中氧化应激的检测。

结论：水中锑的存在和富集对水生生物和人类构成潜在的健康危害。 斑马鱼因其优异的特性而成为研究神经发育和功能的成熟脊椎动物模型。在这项研究中，锑暴露导致斑马鱼胚胎发育过程中的形态异常和神经功能下降。锑诱导斑马鱼胚胎的神经毒性可能与氧化应激有关。锑通过打破ROS产生和抗氧化防御之间的平衡而引起氧化应激，进一步导致标记基因表达、AChE活性和星形胶质细胞活力的下降，并最终影响斑马鱼胚胎的神经行为表型。因此，未来的治疗方法可能需要在促进和抑制氧化应激之间取得平衡，以防止摄入锑引起的神经系统氧化应激。这些发现不仅加深了我们对锑对斑马鱼胚胎神经毒性的认识，而且为锑对人类神经发育和神经病的潜在不良影响提供了新的见解。然而，还需要更多的研究来全面评估锑对水生生物和人类健康的影响。

原文出自：Developmental neurotoxicity of antimony (Sb) in the early life stages of zebrafish - ScienceDirect