一种新型子宫颈炎症内脏痛大鼠模型

摘要：子宫颈内脏疼痛的治疗是一个重要的临床问题。这种内脏疼痛的潜在机制仍不清楚，主要是由于缺乏可靠的模型。本研究旨在开发和评估子宫颈炎症引起的大鼠疼痛模型的性能。根据注入子宫颈的溶液将大鼠随机分为六组：生理盐水、赋形剂、辣椒素（0.3 mg、0.6 mg、0.9 mg）、辣椒素0.9 mg +吗啡（每组n = 15）。通过计算机视频系统记录颈部注射后的自发行为，并进行离线分析。基于Pearson的相关分析和回归分析，从特定行为中导出了一个新的疼痛评分计算公式。检测c-Fos在脊髓中的表达。脊髓中的疼痛评分和 c-fos 表达在 0.9 mg 辣椒素组中最高，在生理盐水和赋形剂组中最低。鞘内注射吗啡可显著降低脊髓中的疼痛评分和 c-fos 表达。大鼠宫颈内注射辣椒素可作为一种实用的炎性宫颈痛模型，并可用我们的新疼痛评分进行评价。这一模型将进一步揭示子宫颈内脏疼痛的机制。

关键词：c-Fos  炎症 疼痛行为 疼痛模型 子宫颈  内脏痛

摘要：起源于子宫颈的内脏痛的治疗，例如分娩痛，子宫颈相关的骨盆痛，子宫颈癌和急性子宫颈扩张的医源性疼痛，是一个重大的临床问题。需要更好地了解导致源自子宫颈的内脏疼痛的神经生理学基础的机制，以促进某些成功治疗策略的发展。 然而，人们对这种疼痛机制知之甚少，主要是由于缺乏理想的实验性疼痛模型。虽然有几种动物或人类模型被引入作为研究子宫颈疼痛机制的工具，但所有这些模型都模拟了基于子宫颈扩张（UCD）的有害机械刺激。然而，除了机械刺激外，宫颈炎症也与子宫颈的内脏疼痛有关。然而，迄今为止还没有建立子宫颈化学性炎症的实验模型。辣椒素是一种众所周知的瞬时受体电位香草素 1 (TRPV1) 的激活剂，广泛用于诱导动物的刺痛和灼痛感和痛觉过敏，将辣椒素注射到组织中会产生化学炎症。本研究的目的是开发一种由子宫颈炎症引起的内脏疼痛的简单模型。在这里，我们描述了一种化学刺激子宫颈的模型，在清醒、自由活动的大鼠中，将辣椒素注射到子宫颈管中。 我们发现辣椒素刺激可诱导自发性疼痛行为，称为痛觉过敏和脊髓 c-fos 表达。这两个特征对鞘内注射吗啡的抑制都很敏感。在我们的研究中，一种新型辣椒素诱发的宫颈疼痛模型被证明是稳定的。 此外，我们推导出了一个实用的公式，可用于评估内脏疼痛的严重程度。

宫颈注射辣椒素：将辣椒素溶解在 0.5 ml 赋形剂（盐水-乙醇-吐温 80，体积比为 8:1:1）中，并在注射前制备不同浓度（7.5、15、22.5 μg/μl）的辣椒素溶液。溶剂比率基于先前实验的结果，辣椒素剂量和辣椒素注射后持续时间根据我们的初步实验确定。实验前一天大鼠适应测试环境30分钟，并在测试开始前再次适应30分钟。将大鼠短暂麻醉并维持在自主通气。大鼠用 4% 异氟烷在 100% 氧气中以 1 L/min 的流速诱导麻醉。一旦大鼠不再对挤压有反应，它们就会被转移到温控手术板上，并在 0.5%–0.9% 的异氟烷维持麻醉下给药。调整异氟烷的浓度，以防止过度麻醉，以及避免轻麻醉导致得疼痛和自发运动。大鼠保持相对舒适的姿势，仰卧，骨盆抬高 3 cm。 凡士林涂在阴道区域，以避免接触刺激性化学物质。使用圆形金属尖端的无菌微量注射器（50 μl），手动控制速度为8-10 μl/min，将少量溶液（40 μl）注入大鼠宫颈管。注射器针尖插入阴道约2cm，注射后10min取出，在此期间大鼠保持原位，以减少由于液体流动造成干扰的可能性。使用此方法将相同体积的染料注射到完整大鼠的子宫颈管中，以验证药物的局部释放，而没有泄漏到子宫角、阴道或腹腔中。检查员接受过培训，以确保将体积注射到同一区域而不会损坏动物的阴道或子宫颈。

图 1、 宫颈痛模型的建立。(A) 红色直线代表插入大鼠阴道约 2 厘米直到到达子宫颈管的微型注射器。 (B) 将辣椒素应用到子宫颈后大鼠的行为特征。

宫颈辣椒素给药诱发的自发行为：宫颈辣椒素给药相关典型行为：为了确定诱导子宫颈炎性伤害感受所需的辣椒素的有效剂量，进行了初步的辣椒素剂量-反应实验，并观察和评估了自发行为。根据已有的研究和在我们的模型中观察到的动物行为，选择并记录6种典型行为的发生率和持续时间，包括0.3-0.9mg辣椒素注射后的梳理、养育、转头、舔背、驼背和后肢过度伸展。为了准确分析与辣椒素引起的宫颈炎性疼痛相关的每一种特定行为，我们对六种行为的持续时间与不同剂量辣椒素的持续时间进行了 Pearson 相关分析。在六种行为中，舔和转头是仅有的两个 r > 0.4 的参数. 辣椒素治疗组大鼠舔舐腹部和转头的持续时间显着高于赋形剂组大鼠，呈剂量依赖性，而行为持续时间没有统计学显著差异，然而，在赋形剂和辣椒素治疗组之间，行为持续时间（包括梳理、养育、驼背和后肢过度伸展）没有统计学上的显著差异。因此，舔和转头被评估为与子宫颈炎性疼痛显著相关的变量。

回归分析计算疼痛评分的公式：基于多元线性回归方程，拟合与疼痛评分相关性高的参数，反映宫颈疼痛的严重程度。辣椒素给药后前1.5 h舔舐和扭头时间的回归分析表明，辣椒素剂量与疼痛评分呈基本线性关系。

辣椒素对疼痛评分的时间和剂量效应：我们检查了大鼠子宫颈辣椒素注射后不同时间窗内的疼痛评分。辣椒素（0.3毫克，0.6毫克，0.9毫克）应用于子宫颈引发的疼痛评分在注射后的前1.5小时内稳定增加。与 0.3 mg 辣椒素相比，在给药后的前 1.5 小时内，更高剂量的辣椒素（0.6 mg 和 0.9 mg）导致疼痛评分显著增加辣椒素0.9mg组的疼痛评分显著高于辣椒素0.3mg组，而辣椒素0.9mg组和辣椒素p0.6mg组之间的差异无统计学意义。为了进一步探讨辣椒素给药后内脏疼痛敏化的时程特征，我们分析了最初1.5-h和1.5-3-h期间的疼痛评分。结果表明，疼痛评分的升高主要发生在辣椒素注射后的头1.5 h，尤其是最初的0.5-1 h。与前 1.5 小时相比，疼痛评分的累积增加在随后的几个小时内明显减弱，趋于平稳。

图2 、宫颈注射辣椒素对疼痛评分的影响

吗啡对宫颈辣椒素给药诱发的自发行为的影响：吗啡是一种经典的阿片受体激动剂，在临床实践和基础研究中广泛用于逆转疼痛。 在本研究中，为检查辣椒素引起的疼痛，在将0.9 mg辣椒素注入子宫颈之前10分钟，大鼠鞘内给予5μg吗啡作为预处理。行为结果表明鞘内注射吗啡显着降低了疼痛评分。 鞘内注射吗啡的效果进一步验证了该模型对辣椒素所致宫颈疼痛的疗效。

子宫宫颈辣椒素给药引起的宫颈炎症的测量：使用子宫和局部子宫颈以及阴道的 H&E 染色来测试辣椒素的炎症作用。 在辣椒素或赋形剂给药后 4 小时采集组织进行 H&E 染色。对照组大鼠的子宫、宫颈和阴道组织显示结构正常，没有组织病理学变化。相反，宫颈注射辣椒素后，子宫内膜充血，炎性细胞增多，组织肿胀，空泡变性严重，组织层次结构紊乱，界限不清，表明辣椒素引发了明显的宫颈炎症。但各组大鼠子宫或阴道未见组织病理学改变，说明药物未渗入子宫角或阴道。

图 3、子宫、子宫颈以及阴道组织的苏木精和伊红染色。

子宫颈辣椒素诱导脊髓c-fos表达模式及吗啡对其表达的影响：

子宫颈辣椒素给药后，c-Fos在下胸段和上腰段脊髓III-V层的表达呈剂量依赖性增加。该结果与解剖学一致，其中子宫颈受腹下神经和盆腔神经支配。在浅层（I‒II层）和中央管区（X层），将辣椒素注入宫颈导致脊髓中c-fos表达显著增加。在鞘内注射 5 μg 吗啡预处理的情况下，0.9 mg 辣椒素诱导的 c-fos 活化显著降低，仅在背角浅部和背角深部有少量c-fos免疫阳性细胞，中央管区有少量染色。

图4、不同治疗后脊髓深背角（III‒V层）c-fos免疫反应性表达的差异定量。

宫颈辣椒素给药后外周痛觉过敏及吗啡对牵涉性痛觉过敏的影响：在记录宫颈辣椒素注射引起的内脏疼痛行为后，我们测试了辣椒素注射后1.5小时和3小时大鼠的PWL和缩爪阈值（PWT）。结果发现注射辣椒素后 PWL 和 PWT 的值都降低了，表明对子宫颈的有害刺激也会引起外周痛觉过敏。鞘内注射吗啡可逆转PWL和降低PWT。这与临床上内脏痛常向体表及远处放射的现象相符合。

TRPV1和p-ERK与子宫内注射辣椒素引起的内脏痛的关系：为了探索辣椒素诱导宫颈痛转导的潜在分子机制，检测了宫颈、背根节和脊髓 (SC) 中 TRPV1 和 p-ERK 1/2 的蛋白表达水平。与赋形剂组相比，辣椒素0.9 mg组TRPV1和p-ERK 1/2的宫颈蛋白表达显著增加。宫颈辣椒素给药后4 h，大鼠DRG中TRPV1和p-ERK1/2蛋白表达水平显著高于赋形剂处理的大鼠。PCR结果表明，辣椒素处理组腰骶脊髓中TRPV1的mRNA转录水平也显着升高。

结论：我们探索了一种稳定可靠的子宫颈有害刺激引起的内脏疼痛动物模型，并提出了一种简单的数值方法来评估疼痛的严重程度。将辣椒素注入大鼠子宫颈会导致内脏疼痛和局部炎症变化以及外周痛觉过敏，并导致大鼠子宫颈、DRG 和脊髓中 TRPV1 表达显著增加。

原文出自：A novel visceral pain model of uterine cervix inflammation in rat - ScienceDirect