斑马鱼试验：早期发育需要 Mvda

摘要：在汗孔角化病中发现MVD 基因突变，汗孔角化病被认为是一种皮肤特异性自身炎症性角化病。 然而，MVD基因的生物学功能在很大程度上仍然未知。 因此，我们分析了与人类 MVD 基因同源的斑马鱼 mvda 基因在发育中的功能。采用Morpholino反义寡核苷酸技术产生mvda功能丧失表型。通过RT-PCR和Sanger测序证实mvda基因敲除。通过扫描电镜和透射电镜观察表皮形态。利用Tg（fli1a:EGFP）y1转基因株进行血管生成研究。此外，用吖啶橙染色法检测体内凋亡细胞。正如预期的那样，mvda 功能丧失斑马鱼表现出异常的表皮形态。 此外，我们在缺乏 mvda 的斑马鱼中观察到躯干血管生成中的异位芽和尾静脉丛的形成受损。 此外，在 mvda 基因突变斑马鱼的尾部、心脏和眼睛中发现细胞凋亡增加。这些发现表明mvda在斑马鱼早期发育中起着重要作用。这是斑马鱼mvda基因的首次体内敲除研究，这可能为深入了解人类MVD基因的生物学功能提供帮助。

背景：甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）是甲羟戊酸途径中将甲羟戊酸-5-焦磷酸催化为异戊烯-5-焦磷酸的关键酶。甲羟戊酸途径的最终产物包括胆固醇、类固醇激素和非类固醇类异戊二烯，它们是细胞存活所必需的。MVD 编码基因的突变是中国汗孔角化病(PK)患者中最常见的原因，汗孔角化病被认为是一种皮肤特异性自身炎症性角化病。PK 表现出常染色体显性遗传模式，其特征是多发浅表角化病变，角化边界略微升高。然而，MVD基因的生物学功能在很大程度上仍然未知。斑马鱼器官的发育和功能与人类惊人地相似，突变或转基因鱼容易建立疾病模型。斑马鱼已成为研究脊椎动物基因功能的热门生物。该物种几乎透明的胚胎，以及通过基因敲除或过表达加速遗传研究的能力，导致斑马鱼在脊椎动物基因功能的详细研究中得到广泛应用，并越来越多地用于人类遗传疾病的研究。本文采用斑马鱼模型和吗啉寡核苷酸（MO）敲降技术，对斑马鱼早期发育过程中与人类MVD基因同源的斑马鱼甲羟戊酸 (二磷酸) 脱羧酶a（mvda）基因的生物学功能进行了研究。斑马鱼 mvda 基因与人类 MVD 基因的同源性为 65.6%，蛋白质水平上的保守性为 67.5%。 MO敲除基因功能是研究斑马鱼感兴趣基因的最熟悉的遗传方法。通过特异性干扰mRNA转录物，MO避免了由有害突变而非基因MO敲降诱导的遗传补偿反应。报道mvda在斑马鱼早期发育过程中表达。用MO抑制mvda的表达可阻断斑马鱼早期胚胎发生，导致显著的发育缺陷。变形胚胎显示表皮和血管缺陷，以及整个尾巴、心脏和眼睛的细胞凋亡增加。 这些体内结果表明，mvda是斑马鱼发育早期阶段的关键因素。发现为理解 MVD 的功能提供了第一条线索。

mvda缺乏会损害斑马鱼的正常发育：斑马鱼胚胎发育阶段mvda基因的表达模式不同。将第3内含子序列插入转录本，产生mvda基因敲降，并通过逆转录PCR（RT-PCR）和Sanger测序证实其有效性。描述了受精后2d（dpf）和4-dpf时mvda突变体的大体形态表型，包括皮肤缺损、心包水肿、尾静脉积血等。

mvda功能异常导致斑马鱼发育缺陷。对12个胚胎发育阶段（0.2 hpf、1 hpf、2 hpf、3.7 hpf、6 hpf、24 hpf、30 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf、120 hpf和144 hpf）的定量实时PCR（qRT-PCR）显示了mvda在胚胎发育过程中的不同表达模式。B 通过 RT-PCR 和Sanger测序证实了 mvda 敲除的有效性。 斑马鱼 mvda 基因被特定的吗啉反义靶向，以防止外显子 3 (E3I3-MO) 的正确剪接。跨越mvda外显子1（正向）和外显子4（反向）的引物检测野生型（非突变体）转录物或插入内含子3的转录物的存在。从对照MO和E3I3-MO在2-dpf处注射胚胎的mvda转录物的RT-PCR，证明插入内含子3。Sanger 测序验证了野生型序列和内含子 3 插入序列。C-J 2-dpf 和 4-dpf 的大体形态。 与对照组相比，mvda 敲除表现为脑积水（E，蓝色箭头），眼部缺损（E，I，蓝色箭头），心包水肿（E，I，红色箭头），尾静脉积血（E，F） ，红色圆圈区域）和皮肤缺陷（J，黑色箭头）。

mvda基因敲除引起表皮异常：用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对mvda突变体（4-dpf）仔鱼的表皮进行了观察。mvda突变体的角质形成细胞显示出曲折的结构和不规则的微脊间隔，表现出外表面的针状结构紊乱。对照组的细胞质角蛋白丝平行或成直角排列。然而，这些规则排列在mvda变体中发生了改变。此外，还观察到其他异常，如粗面内质网扩张、线粒体肿胀、有丝分裂吞噬和细胞-细胞接触破裂。

4dpf对照鱼和mvda突变体斑马鱼皮肤表面的扫描电镜观察。A、 B对照组显示界限清晰的角质形成细胞，有规则排列的微脊（B，白色箭头）。C、D mvda-e3i3-MO 注射斑马鱼显示角质形成细胞具有缩小的边界和微脊。 微脊显示出曲折的结构和不规则的间隔（D，白色箭头）。 dpf，受精后天数。

4dpf 对照MO和mvda吗啉的仔鱼透射电镜观察。A、 B对照组的角质形成细胞显示规则排列的针状突起（黑色箭头）和细胞质角蛋白丝。C、D 注射 mvda-e3i3-MO 的斑马鱼的角质形成细胞显示出无序的针状体（黑色箭头）、无序的细胞质角蛋白丝、扩张的粗面内质网（黄色星号）、肿胀的线粒体（红色圆圈）、自噬体（红色箭头） ，囊泡（红色星号）和细胞间接触破裂（蓝色星号）。

mvda 的缺失会导致体内血管缺陷：注射对照MO的Tg（fli1a:EGFP）y1斑马鱼胚胎，在2-dpf处显示有规则的血管结构，有自然节段间血管（ISVs）和背侧纵向吻合血管（DLAV）。相反，注射mvda-e3i3-MO的斑马鱼躯干血管生成受损，不完全ISV和背主动脉异位芽（DA）数量较少。

吗啉基因敲除mvda对斑马鱼躯干血管生成和CVP形成的影响  A-F  Tg(fli1a:EGFP)y1 胚胎在 2dpf 的代表性荧光图像，血管结构通过 eGFP 荧光可视化。2dpf对照胚胎尾静脉丛（CVP）在尾部形成蜂窝状结构。然而，缺乏 mvda 的斑马鱼在 2dpf 时的 CVP 形成环数减少了 7.8 倍。这些缺陷与mvda突变体的尾静脉积血表型一致。

与正常对照组相比，注射mvda-e3i3-MO的斑马鱼出现减鳍表型。背侧、腹侧、骨盆和尾鳍萎缩或缺失，表明mvda变体的鳍面积减少了13.9倍。这表明mvda基因敲除可诱导细胞的抗增殖。吖啶橙染色法检测体内死亡细胞。注射对照-MO 的斑马鱼在整个生物体中几乎没有或没有凋亡细胞，而 mvda-e3i3-MO 诱导的斑马鱼则显示染色显著增加，尾部凋亡增加 25.8 倍。同样，在mvda突变体的心脏和眼睛中也发现了增强的细胞凋亡。

mvda缺乏诱导鳍减少表型和尾部特异性凋亡。

吗啉基因敲除mvda诱导心脏和眼睛细胞凋亡

结论：结果显示了由 mvda 敲除引起的斑马鱼发育中的病理改变。斑马鱼的早期发育需要 mvda。 我们的发现可能有助于理解人类 MVD 基因的生物学功能。

原文出自：Mvda is required for zebrafish early development | SpringerLink