斑马鱼光感受器的生物化学和生理学

摘要：所有脊椎动物都具有典型的视网膜，外层视网膜具有光敏光感受器。这些感光器有两种：杆状和锥状，分别适应弱光和强光条件。它们都表现出一种特殊的形态，有很长的外段，由排列有序的盘状膜组成。这些盘状膜含有许多蛋白质，其中许多参与视觉传导级联反应。该通路将光刺激转化为生物信号，最终调节突触传递。斑马鱼因研究脊椎动物光感受器的功能而受到欢迎。 在这篇综述中，我们介绍了这个模型系统及其对我们理解光感受的贡献。

简介：所有脊椎动物都具有典型的视网膜，外层视网膜具有光敏光感受器。这些光感受器有两种：杆状和锥状。 杆状光感受器的特点是光敏感度较高，动力学较慢，主要介导单色弱光视觉。另一方面，锥形光感受器在强光下起作用，传达亮度和颜色信息。在脊椎动物中，根据吸收峰的不同，它们有四种不同的亚型。两种光感受器类型都具有特殊的形态，由排列有序的盘状膜组成的外段，其中包含视觉转导级联的蛋白质。这种生化途径将光的物理刺激转化为生物信号。外段是经过修饰的初级纤毛，通过轴丝连接到富含线粒体的内段。光感受器的突触是脊椎动物大脑中最复杂的突触之一。已经在不同的模式生物中深入研究了光感受器。 生物化学家喜欢牛的大眼睛，因为它们的蛋白质产量高。电生理学家偏爱两栖动物，因为它们具有相对较大的光感受器，而遗传学家则主要关注啮齿动物的眼睛，因为这些系统具有遗传便利性。

最近，小型热带硬骨斑马鱼加入了视网膜研究模型系统的行列。除了它们有利的生物学特性，例如体型小、易于维护和后代数量多之外，它们的视觉系统还有一些特性使该模型系统受到视觉科学家的喜爱。与以杆状为主的两栖动物或啮齿动物视网膜不同，斑马鱼中的大多数光感受器是视锥细胞，斑马鱼仔鱼约占 92%，成年斑马鱼约占 60%。仔鱼视网膜也可作为灵长类动物中央凹的模型。此外，超过70%的人类基因在斑马鱼基因组中有直接的同源基因，使斑马鱼成为研究人类眼睛或更具体的锥体疾病的理想模型。在过去十年中，操纵斑马鱼的遗传工具得到了大规模扩展，包括 DNA 插入、精确控制的转基因表达和 CRISPR/Cas 基因组编辑。由于斑马鱼视网膜在很早的阶段（受精后 3 天 (dpf)）就开始传递视觉信息，因此可以在仔鱼早期阶段评估视觉系统的功能。 最后，斑马鱼仔鱼是透明的，非常适合实时成像。

斑马鱼外层视网膜：斑马鱼视网膜有一个杆状结构和四个形态和光谱上不同的视锥亚型，即短单视锥（紫外线敏感）、长单视锥（蓝色敏感）、双视锥附属成员（绿色敏感）和双视锥主成员（红色敏感）。双锥体存在于大多数脊椎动物中，但在大多数胎盘哺乳动物、软骨鱼和鲶鱼中不存在。斑马鱼光感受器通过缝隙连接进行偶联，主要由连接蛋白35（哺乳动物Cx36的斑马鱼同源物）介导。鱼光感受器耦合受生物钟调节，夜间增加锥-锥和杆-锥耦合。在缺乏瞳孔反射的情况下，许多低等脊椎动物发展出视网膜运动来适应光照条件的变化。在黑暗中，光感受器内段的一个移动部分，称为肌样，驱动锥体拉长和杆体收缩。同时，视网膜色素上皮 (RPE) 的色素颗粒集中在 RPE 的基底部分。通过这种方式，锥体外段被深埋在基底RPE内，而杆外段则由于远离色素颗粒而最佳地暴露在入射光下。在光适应过程中，视锥细胞收缩而视杆细胞伸长，同时色素颗粒向 RPE 的顶端部分易位。色素颗粒需要大约一个小时才能迁移到完全适应光照的位置，而双锥外段收缩在大约20分钟内完成。成年视网膜的纵向切片表明斑马鱼中不同的光感受器被分成不同的层。杆状核位于所有锥状核的远端。 UV 锥体、蓝色锥体和双锥体的核分别位于外视网膜的远端、中间和近端区域。成年斑马鱼视网膜中的视锥细胞有序排列成一行镶嵌图案，其中红色锥体与蓝色锥体相邻，而绿色锥体与UV锥体相邻。

仔鱼视网膜的情况有所不同，其中感光细胞呈各向异性分布。所有锥体类型都集中在地平线和较低的视野，这可能会介导色觉。UV锥密度在地平线上方约 30° 处出现峰值，这对于视觉猎物至关重要。这种各向异性分布适用于自然视觉环境中服务于行为需求的光谱内容。

成年斑马鱼视网膜和光感受器

视觉传导级联：光感受器的主要功能是捕获可见光的光子，随后将这种物理刺激转化为生物信号，最终通过光感受器突触改变神经递质谷氨酸盐的释放。视觉转导级联及其调控是最容易理解的三聚体 G 蛋白信号通路之一。所有的反应都发生在光感受器的外段，其中大部分与膜有关。

锥体光感受器形态（a）。脊椎动物视觉传导级联和钙调节失活过程的示意图（b）。

光感光器外段是一个圆柱形结构，由有序堆叠的圆盘状膜组成，允许高浓度的跨膜视觉色素并增加光子捕获的可能性。视杆和视锥光感受器共享一个大体相似的视觉转导级联，但对许多级联组件采用视杆或视锥特异的蛋白质亚型。这些重复基因的产生、缺失和命运为硬骨鱼视觉转导级联增添了迷人的复杂性，这超出了本综述的范围。 然而，下面要讨论的众多基因变异是过去全基因组重复的直接结果。视觉传导级联是由视蛋白对光子的吸收引起的。这些G蛋白偶联的7-跨膜受体通过形成光色素复合物的希夫碱共价结合到光敏生色团。吸收光子后，光色素复合物中的生色团异构化为全反式视黄醛，通过诱导转化变化激活视蛋白。斑马鱼锥体共表达 8 个锥体视蛋白，即 opn1sw1 、 opn1sw2 、 opn1mw1 、 opn1mw2 、 opn1mw3 、 opn1mw4 、 opn1lw1 和 opn1lw2。因此，有四种绿色（短波长）和两种红色（长波长）视蛋白变体。这些多个rh2和lws基因的表达在发育过程中遵循时空顺序。杆状光感受器仅表达单杆视蛋白基因 rho 。 人类视杆蛋白突变可能导致夜盲症或视网膜变性，而视锥细胞缺陷可能导致色盲。多年来，基于维生素 A1 的感光色素被认为是标准实验室条件下斑马鱼感光器中存在的唯一感光色素。基于 A1 的光色素的峰值吸收光谱 (λmax) 显著不同，覆盖了体内 355 nm (UV) 至 558 nm (红色) 的宽光谱。这说明斑马鱼体内存在一个功能性的A1-A2光色素交换系统。这种交换系统经常在淡水鱼类和两栖动物中观察到，与海洋和陆地环境相比，它可能适应淡水中的红移光环境。调节光色素的另一种机制是改变视蛋白表达水平。据报道，TH 处理可减少 lws2 (548 nm) 和 rh2-1 (467 nm)，同时增加仔鱼中的 lws1 (558 nm) 和 rh2-2 (488 nm)，有利于具有更长 λmax 的视蛋白。这两种机制都会使斑马鱼光感受器光谱灵敏度发生红移。 此外，在 TH 受体缺陷鱼中，设计成红锥体的视网膜祖细胞被转化为紫外线锥体，为 TH 调节长波视觉提供了另一种机制。

除了视觉视蛋白外，斑马鱼基因组还包含 32 个非视觉视蛋白基因，这些基因编码视蛋白，形成具有不同发色团的功能性光色素。

视觉转导调节：在生化水平上，视觉转导主要受其失活动力学的调节。 要停用视觉转导级联，需要停用 R* 和 Gα-PDE* 复合物并恢复 cGMP 浓度。R* 的寿命受到抑制蛋白的严格调节，抑制蛋白通过与其磷酸化形式结合而有效地灭活光色素。 因此，R*失活的第一步是磷酸化。. R* 被 G 蛋白偶联受体激酶 (GRK) 磷酸化。 小鼠和大鼠在视杆细胞和视锥细胞中仅表达 GRK1，而人类在视杆细胞中表达 GRK1，视锥细胞中表达 GRK1 和 GRK7。在斑马鱼中，两个视觉grk基因都以两个平行序列的形式存在。grk1a仅在杆状细胞中表达，grk1b和grk7a在所有锥体细胞中表达，grk7b仅在UV锥体细胞中表达。grk7a 敲除模型在很大程度上产生延迟的 ERG 响应恢复并降低 OKR 中的时间对比敏感度。grk1a在斑马鱼杆状细胞中的过度表达对杆状细胞的光响应影响很小，表明内源性grk1a蛋白已经处于饱和水平。抑制蛋白的结合使磷酸化的光色素完全失活。在小鼠视网膜中，视杆细胞 (ARR1) 和视锥细胞 (ARR3) 抑制蛋白在视锥细胞中共同表达。ARR1基因突变是人类Oguchi病的病因之一。在斑马鱼中，arrsa 和 arrsb（Arr1 的直系同源物）在视杆细胞中表达，而 arr3a 存在于双锥细胞中，而 arr3b 存在于蓝色和 UV 锥细胞中，表明两个旁系同源物的亚功能化。 arr3a 敲除导致 ERG 反应恢复严重延迟和时间对比敏感度降低。

G蛋白信号调节因子9（RGS9）作为GTPase激活蛋白，使 Gα*-PDE 复合物失活。哺乳动物有一个 Rgs9 基因，而斑马鱼有两个 rgs9 基因，其中 rgs9a 在视锥细胞中表达，而 rgs9b 在视杆细胞中表达。在小鼠中使用Rgs9过表达进行的一项里程碑式的研究表明，Rgs9在限制视觉传导恢复的速率方面起着至关重要的作用。光感受器特异性GCs受结合钙离子的鸟苷酸环化酶激活蛋白（CGAPs）调控。

哺乳动物有两种光感受器特异性GC，GC-E（称为GC1）和GC-F（称为GC2），这两种细胞都在杆状细胞和锥体细胞中共同表达。GC-E 更集中在视锥细胞中，而 GC-F 在视杆细胞中的表达更为突出。GC-E基因突变已被证实可导致Leber先天性黑蒙1（LCA1），这是一种严重的人类儿童失明。斑马鱼拥有 3 个 GC。 GC-E（称为 GC1）、GC-F（称为 GC2）和 GC-D（称为 GC3）分别由 gucy2e、gucy2f 和 gucy2d 编码。 gucy2e 和 gucy2f 都在视杆细胞和 UV 视锥细胞中表达，而gucy2d编码所有锥细胞亚型中唯一的锥细胞特异性GC。GCAP1和GCAP2在哺乳动物的杆状细胞和锥体细胞中表达。人类（而不是小鼠）基因组也处理锥体特异性 CGAP3。 斑马鱼光感受器表达 6 个 GCAP，其中 gcap3、4、5 和 7 仅限于视锥细胞，而 gcap1 和 2 仅在杆状细胞和紫外线视锥细胞中表达。这些亚型显示出对 GC 激活的不同 Ca2+ 敏感性、Ca2+/Mg2+ 依赖性构象变化和 Ca2+ 结合亲和力。

外段：特化的初级纤毛

光感受器外段经过强烈修饰的特化初级纤毛，共享纤毛的许多一般结构和生化特征。因此，连接纤毛，在其他细胞类型中被称为过渡区，连接外段和内段，介导双向蛋白质运输。外段不断受到光子的轰击，其完整性受到自由基氧物种的威胁。由于光感受器，像大多数中枢神经系统的神经元一样，不能被替换，光感受器通过更新其外段不断地使自己恢复活力。外段的尖端，包含最古老和可能受损的膜，被 RPE 细胞吞噬和消化。 尽管外段更新/脱落对于光感受器稳态和存活至关重要，但对其调控的分子机制仍知之甚少。最近对斑马鱼的研究有助于我们理解光感受器外段脱落和更新的分子机制。斑马鱼非常适合转基因标记细胞结构或细胞。Willoughby等人设计了一个稳定的热休克诱导荧光膜蛋白，使他们能够跟踪杆外段的更新和脱落，作为经典放射性标记方法的更新实验方法，然后被用于高含量的小分子筛选，其中确定了环氧合酶参与外段生长，γ分泌酶参与外段脱落，mTOR参与RPE吞噬。

带状突触：非尖峰光感受器响应和适应广泛的光强度。光诱导的CNG通道关闭产生膜电位的梯度变化，进而调节突触前终末强直性神经递质谷氨酸的释放。这种分级的信号传递是由特殊的带状突触促进的，带状突触在其表面的活动区附近有密集的突触小泡排列。对斑马鱼的研究有助于确定带状突触的关键组成部分及其在信号传输中的功能。Ribeye 是突触带中含量最丰富的蛋白质。Ribeye 是突触带中含量最丰富的蛋白质。 在斑马鱼视网膜中，ribeyea 和ribeyeb 都存在于光感受器中，而ribeyea 也在双极细胞中表达。 ribeyea 的下调会降低 OKR 并减少色带长度和数量。Synj1是一种多磷酸肌醇磷酸酶，在常规突触中调节网格蛋白介导的内吞作用。光感受器L型电压依赖性钙通道（Cav1.4）位于突触带附近，介导胞吐作用。在黑暗中，它们被去极化的光感受器膜电位打开，导致钙依赖性谷氨酸盐释放。Cav1.4 是异源多聚体蛋白复合物，由 CACNA1F 编码的成孔 α1F 亚基和分别由 CACNB2 和 CACNA2D4 编码的辅助 β 和 α2δ 亚基组成。CACNA1F 基因突变导致人类 X 连锁先天性静止性夜盲症 2 型和锥杆营养不良。在斑马鱼中发现了两个类似物cacna1fa和cacna1fb，cacna1fa在光感受器中表达，而cacna1fb仅存在于视网膜内部。斑马鱼在夜间至少在仔鱼的视网膜上表现出一种特殊的带状突触解体现象。在光照开始时，突触前结构被迅速重组以发挥功能。这种不寻常的机制可能是为快速生长的幼虫节省能量而进化出来的。

结论：斑马鱼视网膜作为视锥光感受器的重要模型，已经为我们对光感受器维护和功能的理解做出了重大贡献。随着成像和遗传技术地不断增加，斑马鱼将继续帮助我们进一步研究外层视网膜及其疾病。

原文出自：Biochemistry and physiology of zebrafish photoreceptors | SpringerLink