影响药物临床前研究结果预测有效性的因素

药物研发的临床前评价研究中，除了选择合适且理想的小鼠疾病模型外，还应该清醒意识到，有许多因素可以直接影响到实验结果转化有效性。还是以ALS中枢神经系统疾病损伤研究为例，小鼠年龄、性别和环境等也是重要的影响因素。不同物种品系都有自己独特寿命、组织特异细胞生命周期、氧化应激反应、以及基因表达谱特征等，而这些特征都与年龄相关，可直接影响到年龄相关疾病进程的差异。

年龄与ALS关系也受到环境因素影响，比如，饮食和紧张压力等。不同动物饲养环境及研究课题组会有不同动物种群品系的繁育管理体系与方法，对动物紧张压力和行为反应产生不同影响。性别是ALS的危险影响因素，雄性较雌性更倾向发生ALS疾病，雌性ALS小鼠模型相对活得也更长。 

虽然，人与小鼠的基因组有接近98%的相似性，但在DNA甲基化或组蛋白修饰等表观遗传学方面，却存在明显物种差异，从而影响到基因表达的可变性。物种间器官组织系统的解剖学和生理学不同，比如人与小鼠大脑解剖学上的显著差异，也会影响到ALS疾病表型（中枢神经系统和骨骼肌）的差异及药物反应。

如何提高小鼠疾病研究转化效率，也是药物临床前评价研究面临的挑战。过去10多年来，在十几个ALS治疗药物临床前动物试验中，都表现有缓解ALS疾病表型效果，但进入人体临床试验，最终只有一个成功。药物临床试验失败率超过80%。

美国ALS治疗发展研究所（TDI）曾经对超过100个ALS潜在治疗药物，重新应用ALS小鼠疾病模型进行验证实验发现，许多以前在该小鼠疾病模型上验证有效的药物，却多在该研究中无效。我们现在已经知道，TDP-43突变小鼠所表现的疾病病理特征与临床患者有明显差异，比如ALS患者时间伴随的进行瘫痪，而TDP-43突变小鼠疾病模型未出现。并且，小鼠疾病模型的步行与抓力强度等反映肌肉损伤改变也只是呈轻度变化，小鼠最终死亡是因急性肠道平滑肌损伤引起的肠道运动障碍，而非进行性肌肉衰退所致。因此，虽然该TDP-43突变小鼠疾病模型，可以用于药物作用相关疾病机制性方面的研究，但却难以胜任针对延长ALS患者寿命的药物临床前评价研究。

该ALS TDI研究结构还通过对过去4年近5500只用于ALS药物治疗组与对照组SOD1小鼠，进行大量而系统研究分析发现，所有小鼠都显示SOD1基因特定突变。几乎90%SOD1突变小鼠的寿命为134天左右（前后相差10天时间左右）。然而，在仔细分析小鼠相关资料情况后，提出了4个可能影响小鼠寿命长短的干扰因素。这里需要特别强调的关键点是，这些影响小鼠寿命长短差异的4个干扰因素，是经过对上百只多代小鼠的仔细检测分析，才能被挖掘观察到的。比如，小鼠疾病模型研究中，有没有将与研究疾病无关的死亡小鼠剔除？有没有考虑小鼠性别因素？有没有将同窝小鼠分开至实验治疗组和对照组等？因为SOD1雄性小鼠的疾病症状出现时间及死亡发生较雌性小鼠约早一周时间。如此一周时间，就是4%生存变化差异，很容易在药物效果评价中被误解。再有，就是小鼠疾病模型构建策略的关键问题，即小鼠引入突变基因的拷贝数是多少？这些随机重复插入的基因，通常并不是按生殖细胞分裂稳定传递至下一代的，因此，需要对繁殖小鼠进行常规而持续检测鉴定，以确保繁殖后代小鼠转基因拷贝数没有减少，从而防止可能导致小鼠疾病症状减弱的自发性现象。

所以，关于如何降低小鼠药物临床前实验研究中，可能出现结果假阳性问题，研究者建议如下：

1. 排除实验中无关小鼠，比如实验结果中，应该去除因错误操作而造成的与疾病不相关的小鼠死亡;

2. 平衡小鼠性别，因为雄性与雌性在疾病症状表现方面有差异，从而可能干预了温和药物的治疗效果;

3. 分开同窝后代小鼠到实验组，因为将同窝后代小鼠放入同一实验组，可引起实验结果偏差;

4. 确保研究基因表达及活性，因为引起疾病发生的基因，常常不能稳定可靠遗传。如果插入基因拷贝数丢失，小鼠疾病症状严重性会减弱，药物效果也会随之表现较其本身更加有效。

应用ALS小鼠疾病模型开展转化医学研究，还应考虑到影响药物临床前实验研究结果的其他因素。比如，ALS小鼠疾病模型实验研究的评价方法，多以定性检测分析，且受主观影响较大评价方法为主，包括握力强度、吊挂时间、步态分析，以及神经学分数等。如此缺乏客观定量检测分析评价方法，不利于不同实验研究结果的分析比较。另外，目前的药物临床前评价研究，多缺乏随机分组及非双盲法操作原则，自然也影响到实验结果的客观与完整性。特别需要提醒的是，转基因小鼠模型是建立在近交系上，具有遗传背景同质化特点。而临床ALS患者则都具有多样化的特征。而且，目前的药物临床前评价实验研究，多在疾病症状出现之前，就开始测试了，这也完全有别于实际临床药物试验研究。因此，对于哪些临床上需要患者疾病症状出现后，才使用药物治疗的临床试验，小鼠实验研究中预先给药的实验设计策略与操作，明显缺乏充分理由的。

因此，分析影响ALS药物临床试验失败的可能原因，除了ALS小鼠疾病模型构建策略与方法本身的原因，以及上面介绍的其他影响因素，也有可能是临床试验设计方面的缺陷，包括药物治疗时间选择，剂量，患者数量与选择等。另外，临床研究设计能否真正解答相关问题，比如，有效药物剂量能否抵达作用靶点？药物的非特异性作用是否有可能影响其有效性？药物作用靶点是否真正反映了疾病致病机制过程特征等？

当然，小鼠与人在许多存在的差异，包括解剖学上、代谢免疫学上、中枢神经系统与肠道微生物学组成上，以及实验小鼠的近交系特征等，都让我们意识到，小鼠疾病模型与人疾病是存在差异的，不可能完全模拟人疾病致病过程特征。

因此，为了提高小鼠疾病模型转化可靠性与预测性，也是科学家们一直在努力探索与追求的目标。基于前面介绍的小鼠疾病模型在药物临床前评价研究中的成功应用及其经验教训，科学家们也在不断强调选择正确合适的小鼠疾病模型的重要性与紧迫性，强调不同小鼠疾病模型构建策略与方法特征及其实际应用意义，以及小鼠疾病病理学及症状‍表型特征是否与人相关疾病相似或接近等。必须严格控制药物临床前研究中可能的影响因素，包括小鼠遗传品系、性别年龄组成、饲养环境、动物遗传漂移、肠道微生物组成等；警惕基因条件修饰小鼠模型研究中，应用不同Cre小鼠可能引起的非特异性毒性作用，以及诱导剂Tamoxifen本身可能的毒性作用影响等。

将小鼠疾病模型临床前研究结果有效转化至人相关疾病研究与临床治疗应用，是生物医药研究领域共同奋斗努力的目标。然而，我们必须清楚，小鼠疾病模型毕竟还只是动物模型，有其本身的局限性。但是，应用小鼠疾病开展药物临床前评价研究，已经/也并将继续对生物医药领域研究发展，发挥着极其重大而深远的促进作用。