摘要：颜色图案是许多动物的显著特征，并且具有高度的进化相关性。 在基底脊椎动物中，颜色图案由特殊的色素细胞组成，这些细胞以多层镶嵌方式排列在皮肤中。斑马鱼是脊椎动物颜色模式形成的卓越模型系统，允许基因筛选成为识别复杂生物系统中新功能的有力方法。成年斑马鱼显示出一系列蓝色和金色的横条纹，由黑色的黑色素细胞、银色或蓝色的反射色素细胞和黄色的黄色素细胞组成。这种颜色模式是由自组织产生的，包括由整合膜蛋白介导的所有三种色素细胞之间的直接细胞接触。在这里，我们展示了神经肽信号以全局方式损害条纹图案。 编码甘丙肽受体 1A (npm/galr1A) 或其配体甘丙肽 (galn) 的基因突变导致条纹较少、外观苍白、细胞类型混合，类似于甲状腺肥大的突变体。通过移植npm/galr1A突变囊胚细胞获得的斑马鱼嵌合体表明，所有三种类型的突变色素细胞都能在适当的宿主中形成正常的条纹图案。然而，galr1A在大脑特定区域的表达缺失足以导致野生型鱼类的突变表型。突变鱼中甲状腺激素水平的增加表明，垂体中通过 Galr1A 信号传导的甘丙肽是甲状腺激素途径的上游调节剂，反过来又促进了色素细胞在颜色模式形成过程中的精确相互作用。

关键词：斑马鱼  甲状腺激素  嵌合体  甘丙肽受体1A  神经肽信号  黑色素细胞

斑马鱼条纹的形成是由细胞的自主功能和外在功能介导的：神经肽甘丙肽与脊椎动物的一系列看似无关的功能有关，包括能量代谢和睡眠稳态、食物摄取、认知功能和行为。这些过程都受到多因素的调控，甘丙肽的确切作用很难确定。我们描述了通过斑马鱼大脑中甘丙肽受体 1A 进行甘丙肽信号传导的功能，并在成年鱼的突变颜色模式中清晰显示。大量的突变体和工具导致使我们对斑马鱼复杂而持久的颜色图案形成过程的细胞和遗传基础有了相当深入的了解。不同的受体-配体对调节每种色素细胞类型的规格、增殖和维持。三种不同色素细胞类型之间的相互作用调节了明暗条纹特异的黄色素和反射色素细胞形状，并控制了条纹的宽度。不同色素细胞的精确叠加是图案的关键标志。这些异型相互作用是由完整的膜蛋白介导的，如粘附分子、钾通道和缝隙连接成分（连接蛋白）。正如囊胚移植产生的嵌合体所揭示的那样，这些因子在色素细胞中自主发挥作用。还发现了少量基因，这些基因可能在紧邻色素细胞的组织中表达，从而影响它们之间的相互作用。在皮下和肌间隔处检测到锌指蛋白basonuclin2（bnc2，由bonaparte编码）其影响反射小体和黄体的存活。影响孔隙通透性的水通道蛋白3a的显性等位基因在色素细胞周围的组织中表达时会产生斑点。idefix编码亚精胺合成酶，其突变影响条纹宽度，可能是因为亚精胺作为缝隙连接和其他通道的辅助因子。在这些情况下，当将突变色素细胞置于嵌合动物的野生型环境中时，它们能够形成正常模式。在色素模式形成过程中，有三种内分泌途径参与了色素细胞行为的整体控制。黑素皮质素受体信号控制背腹侧反阴影，胰岛素和甲状腺激素信号影响条纹形成。黑色素细胞中的胰岛素信号需要被 sheddase Bace2 特异性减弱，以确保正确的条纹形成。甲状腺激素的缺乏导致黑色素细胞过多，而黄体细胞处于隐匿的无色素状态。相反，过量的甲状腺激素会导致黑色素细胞数量的减少和黄色素细胞的过度增殖。单个细胞的转录分析表明，在成人模式的形成过程中，甲状腺激素以不同的方式促进黑色素细胞和黄色素细胞的成熟。

npm 突变会削弱所有三种色素细胞之间的相互作用：我们描述了隐性突变体nepomuk（npm），它自发地出现在我们的野生型鱼中。这种鱼只有两条暗条纹，分别位于第一条亮条纹的两侧和第三条亮条纹的腹部。由于在亮条纹和暗条纹之间的边界处致密的反射质体向疏松的反射质体的过渡不太明显，因此它们显示出闪亮的外观。还显示出黑色素细胞密度降低和黄色素细胞数量增加。突变体中由于黑色素细胞在细胞中心聚集而显得苍白；完全分散的黑色素细胞显示比野生型黑色素细胞具有更星状的形状。虽然在早期突变仔鱼中看不到黄色素，但在成年鱼的深色条纹中存在异位致密黄色素细胞。突变体往往以较小的体长达到这些阶段。在突变体中，腹侧暗条纹的黑色素细胞出现得较晚，反射细胞的组织密度较低，覆盖了第一条亮条纹的背侧和腹侧的较大区域。由于它们与其他剩余的色素细胞类型之间的排斥作用，单个突变体的黑素细胞聚集成斑点。这些发现表明，npm突变体中黑色素细胞与黄色素和反射色素细胞之间的相互作用受损，而反射色素和黄色素细胞在全身的增殖和扩散似乎正常。综上所述，这三种细胞类型似乎都受到了异质性相互作用的影响，导致了更为分散的模式和条纹数量的减少。

图1、npm突变损害色素细胞之间的相互作用

图

2、npm在发育和双突变体中的色素模式

为了测试 npm 突变色素细胞是否有能力形成条纹，我们通过将 npm 供体胚胎的卵裂球移植到 nac (mitfa);pfe (csf1ra);rse (ednrb1a) 三重突变宿主中来创建嵌合体。nac;pfe;rse 突变体缺乏参与条纹形成的所有黑色素细胞和黄色素细胞以及 S-反射色素细胞，因此嵌合鱼中的所有色素细胞必须来自 npm 供体。观察到，嵌合鱼（34个移植体中的5个）中的npm色素细胞可以形成条纹图案，条纹宽度正常，边界锐利，在整个背腹侧范围内形成至少三条深色和三条浅色条纹。这表明 npm 突变间接影响色素细胞，色素细胞不需要 npm 活性。令人惊讶的是，当将突变的 npm 卵裂球移植到野生型受体中时，一些嵌合体在整个身体中显示出完整的 npm 突变表型。这表明 npm 衍生的组织导致遗传野生型鱼的整个模式发生全局变化。显示完整突变模式的鱼的频率取决于移植的 npm 细胞的数量。为了评估身体的哪些区域来自突变的供体细胞，我们移植了少量的npm;Tg(ubi:Red) 或 npm; Tg（肌动蛋白：GFP）卵裂球 (~30)进入野生型宿主。虽然大多数得到的鱼看起来正常，但我们获得了 5 只嵌合动物 (<1%)，整个身体中显示出突变表型；所有五条鱼的大脑中都有一片片标记的突变供体组织，其中一条还在肝脏中显示了标记的组织。 这表明大脑中特定的小区域需要 npm 活性。

图3、除大脑外，npm功能在色素细胞中不是必需的

npm编码甘丙肽受体1a：鉴于CRISPR介导的斑马鱼甘丙肽基因敲除产生了与npm相似的色素沉着表型的信息，我们确定galr1A是负责npm表型的候选基因。事实上，我们发现 galr1A 外显子 1 末端的剪接供体位点在 npm 中被重复序列元件破坏。 这导致神秘剪接位点的激活，导致第一个外显子末端缺少 63 个碱基的变异转录物。Galr1A 是斑马鱼中神经肽甘丙肽的四种旁系同源受体之一。galn 和 galr1A 两种基因的功能丧失表型的相似性表明，甘丙肽仅通过这些受体之一 Galr1A 进行信号传导，这是我们在突变鱼中观察到的色素沉着缺陷的原因。

甘丙肽或Galnr1a功能丧失导致突变鱼甲状腺激素水平升高：与先前发表的报告一致，发现甘丙肽和galr1A在斑马鱼的大脑和肠道（微弱）中表达。结合移植结果，发现甘丙肽信号通过 Galr1A 在大脑中起作用，可能通过调节内分泌途径进而控制色素细胞行为。甘丙肽参与调节下丘脑和/或垂体水平的多种内分泌途径，包括甲状腺激素途径。npm 突变体中黑色素细胞的减少和黄色素细胞数量的增加类似于甲亢斑马鱼突变体 opallus 的表型和口服 T3 激素导致的表型。发现甘丙肽或 Galr1A 功能的丧失导致甲状腺激素前体甲状腺球蛋白的转录上调和 T4 甲状腺激素水平升高。为了检测甘丙肽信号调节甲状腺激素分泌的水平，我们分析了上游调节因子促甲状腺激素释放激素（trh）和促甲状腺激素（tsh）的转录水平。虽然在 galn 突变体中两者的表达都增加了，但在 npm 中，trh 水平没有显著改变，tsh 上调水平很低。galn在仔鱼下丘脑前部的细胞簇中表达，而galr1A在头部表达更广泛。鉴于这两个基因在成年鱼脑中的强表达，我们认为甘丙肽信号通过脑下垂体或下丘脑水平的Galr1A作为甲状腺激素产生的负调节因子发挥作用。甲状腺激素水平以不同的方式影响黑色素细胞和黄色素细胞的分化。在仔鱼发育过程中，较低水平的激素会减少黑色素细胞的终末分化和黄色素细胞的再色素沉着。此处描述的突变体中出现的较高激素水平会驱使黑素细胞过早地终末分化，从而限制它们的数量并影响它们与其他色素细胞的相互作用。

图4、甘丙肽受体 1A 在 npm 中发生突变

在斑马鱼中，galr1A的缺失导致与其配体galanin的缺失相似的表型。旁系受体Galr1B、Galr2A和Gal2B显然不能弥补Galr1A在甲状腺激素信号传导和色素模式形成方面的缺失，并且它们的表达在甘丙肽或 galr1A 功能丧失后大多不会改变。可能具有我们在突变体中没有检测到的其他功能。胰岛素信号是另一种影响色素细胞发育和行为的内分泌途径：黑素细胞中过度活跃的胰岛素b信号导致过度增殖和树突状细胞过度增殖。虽然在npm突变体中看到了类似的黑色素细胞形状缺陷，但在突变体中没有检测到insb表达的变化。同样，黑色素皮质素受体激动剂的前体 pomca 的表达没有变化。

目前，我们只能推测 Galr1A 信号在色素细胞之间的相互作用中所起的作用。npm表型与任何已知的参与这些异质性相互作用的色素沉着基因不相似。在斑马鱼颜色模式形成中甘丙肽信号的参与可能为理解这种神经肽功能的分子细节开辟了新的途径。

原文出自：Galanin Signaling in the Brain Regulates Color Pattern Formation in Zebrafish - ScienceDirect