摘要：移植是测定造血干细胞（HSCs）体内功能最常用的方法。尽管已经在斑马鱼中开发了各种 HSC 移植策略，但由于与免疫匹配和预处理毒性相关的挑战，它们并未得到充分利用。为了规避这些限制，我们使用 HSC 缺陷宿主开发了一个简单而强大的移植模型。纯合子 runx1W84X 突变体缺乏特定的造血细胞，包括 HSC 和适应性免疫细胞。因此，它们不需要移植的预处理。在受精后2天，将骨髓细胞移植到runx1突变斑马鱼体内，显著提高了斑马鱼的成年存活率，并产生了健壮、多谱系、持久、连续的重新植入。此外，我们还证明，移植到runx1纯合子突变体中的成功率显著高于植入runx1杂合子中的成功率，这表明移植成功率的提高归因于突变体中的空HSC生态位，而不仅仅是胚胎环境。将骨髓细胞竞争性移植到 runx1 突变体中显示出与鼠骨髓细胞相似的干细胞频率，这证明了该模型在量化 HSC 功能方面的效用。该测定的简化方法和稳健性将有助于扩大其未来在斑马鱼中进行高通量移植实验的可行性，并将促进 HSC 生物学的进一步新发现。

简介：造血干细胞 (HSC) 的独特之处在于其广泛的自我更新能力和生成所有分化血细胞谱系的能力。当供体造血干细胞重新植入宿主的整个血液系统时，这些特征在移植后得到最好的显示。临床上，造血干细胞移植是治疗人类恶性和非恶性疾病的标准方法，也是量化体内造血干细胞功能的重要实验室工具。斑马鱼是研究造血发育的一种成熟模型，但它也有许多优点，使其成为研究移植生物学的一种优秀模型。例如，我们使用高分辨率全生物体成像的能力可以更全面地了解整个 HSC 植入过程。此外，高繁殖力、较短的繁殖时间和较低的饲养成本使斑马鱼成为发现 HSC 移植生物学新调节因子的遗传和药物筛选的理想模型。先前已经使用成年和胚胎受体在斑马鱼中开发了几种HSC 移植方法，每种方法都实现了不同程度的多向移植。从这些研究中，揭示了成年和胚胎斑马鱼移植策略的独特技术挑战。对于胚胎受体，嵌合水平通常很低，可移植的细胞剂量受胚胎体积的限制。但是移植成鱼需要辐照以清除 HSC 生态位和免疫细胞，这不仅对动物有很大的毒性，而且费时费力，从而限制了以高通量能力进行检测的便利性。此外，主要组织相容性复合体（MHC）单倍型匹配在斑马鱼中的作用尚不完全清楚，MHC单倍型匹配对于防止移植物排斥和移植物抗宿主病的发生具有重要意义。借鉴鼠移植的经验教训，我们知道减少或消除HSC和免疫细胞清除需求的基因模型可以改善移植结果。Waskow 等人将含有突变的 KitW/Wv 小鼠与 Rag2 突变的免疫缺陷小鼠结合，以产生无需预处理的改良受体。这些动物允许评估 HSC 功能，而不会出现由辐射或化疗调理方案引起的应激并发症。考虑到类似的目标，我们开发了一个类似的斑马鱼模型。我们的无辐射HSC移植方法使用runx1W84X突变体（以下简称runx1突变体）斑马鱼，它缺乏内源性特定造血细胞，包括HSC和适应性免疫细胞。runx1突变体比具有完整最终造血的胚胎更适合移植受体。我们发现runx1突变体支持真正的造血干细胞的植入，因为移植物可以长期存活并且可以连续移植。然后，我们用这些runx1突变体移植来研究HSC的功能。我们的数据表明存在一定程度的 HSC 异质性，斑马鱼骨髓 HSC 显示出对红细胞、骨髓、淋巴和前体细胞产生不同的谱系输出。通过使用竞争性移植，我们揭示了斑马鱼肾骨髓中的干细胞频率约为 16000 分之一，这一数字与在小鼠骨髓中发现的数量惊人地相似。总之，这些发现揭示了这种新的移植模型在评估斑马鱼HSC功能方面的价值，并揭示了HSC生物学的新见解。

HSC供体细胞制备：从 4 到 6 条安乐死的ubi:GFP 或 ubi:mCherry成年斑马鱼（3 到 9月龄）中解剖供体肾脏，并放入荧光激活细胞分选 (FACS) 缓冲液中（0.9×Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水，5 % 胎牛血清和 1% Pen/Strep）。研磨后，将样品通过 40-μm 细胞过滤器过滤以去除碎片，并在 2500 rpm 下离心 5 分钟进行沉淀。将细胞颗粒重新悬浮在适当量的注射缓冲液中，以产生500个/nL白细胞的浓度。注射缓冲液由每 20 μL 缓冲液含有 500 μM EDTA 和 1 μL TurboDNase 的 FACS 缓冲液组成。

造血干细胞移植：在 2 dpf 时，胚胎被手动去除绒毛膜，用三卡因麻醉，然后放置在注射板（培养皿中的 1% 琼脂糖）上。然后修剪一根非纤维微量注射针，以释放含有约 2500 个白细胞的 5 nL 液滴，并加入到制备的细胞悬液中。针头首先穿过卵黄插入总主静脉。使用29 psi的压力注射细胞。每日移植约 100 到 200 个胚胎。 假注射和未注射的胚胎都用作对照。假注射胚胎只接受注射缓冲液而不接受供体细胞。未注射胚胎的麻醉方法与注射胚胎相同。

图 1. runx1突变体在HCT后表现出强大的植入能力。

植入效果评估：存活的鱼在移植后 2 个月被安乐死，并按上述方法制备来自个体受体的肾骨髓细胞。添加4′，6-二氨基-2-苯基吲哚至最终浓度为1μg/mL，以便于从分析中排除死细胞。在收获肾脏的同时，剪尾用于基因分型。研磨后，肾脏样品通过 40-μm 过滤器过滤到 FACS 管中，并在 BD LSRII 流式细胞仪上进行分析。为了量化嵌合体，我们首先对感兴趣的造血谱系进行门控，然后测定谱系内GFP+细胞的百分比。为了评估所有GFP+供体来源细胞的谱系贡献，对所有GFP+细胞进行门控，然后确定每个造血谱系群体中细胞的百分比。

图 2. runx1 突变体中的植入是多谱系和持久的。

图3. 在runx1突变体中植入的细胞具有连续重新植入的能力。

runx1突变体在HSC移植后表现出强大的植入能力：纯合子 runx1 突变体无法形成明确的血液系统，因此有一个空的 HSC 生态位，并且缺乏通常会促进移植失败和排斥的适应性免疫细胞。基于这些特征，我们假设 runx1 突变体将是优秀的 HSC 移植受者。 为了验证这一假设，为了验证这一假设，我们将成年骨髓细胞移植到 2 个 dpf runx1 突变胚胎，然后评估了存活率和植入率。具体来说，我们从成年 ubi:GFP 斑马鱼 24 中收集了完整的肾骨髓来制备供体来源的细胞，然后将这些细胞注射到 runx1 突变体胚胎的主静脉。未注射和假注射的胚胎作为对照。大多数纯合子 runx1 突变体在生命的前 2 周内死亡，因为它们缺乏明确的血液系统。如果造血细胞移植（HCT）成功地替代了有缺陷的血液系统，我们假设 runx1 突变动物的存活率会提高。 测量并比较未注射、假注射和移植的 runx1 突变体和杂合子的存活率。与未注射的胚胎相比，假注射的突变体的存活率较低，这表明存在一些与移植操作相关的死亡率。与这一观察结果一致，移植的 runx1 杂合子的存活率低于未注射的动物。相反，与未注射（11%）或假注射（8%）小鼠相比，HCT后runx1突变体的存活率显著提高到26%。这些结果runx1突变体造血移植成功。为了直接评估供体细胞植入，我们使用显微镜和流式细胞术评估了移植斑马鱼中 ubi:GFP+ 细胞的存在。移植后5天即7dpf时，GFP+细胞在整个循环系统可见，并集中在发育中的胸腺和肾脏，这是造血的两个主要部位。在移植后 2 个月的整个移植斑马鱼中也很容易检测到 GFP+ 细胞。

为了获得更定量的移植视图，通过流式细胞术评估了 2月龄的移植受者整个肾骨髓中的造血嵌合现象。为了确定植入 runx1 突变体是否优于移植到具有完整确定造血系统的动物中，比较了runx1 突变体和杂合子之间的植入。由于骨髓细胞在所有血细胞中显示出最快的更新，我们首先确定骨髓细胞中供体来源的嵌合体是造血干细胞或祖细胞活性的更敏感的指标。根据前向和侧向散射参数对骨髓细胞进行门控，然后确定 GFP+ 细胞的百分比。斑马鱼≥5%的供体来源的骨髓嵌合体被定义为植入。根据这一指标，59%存活的移植runx1突变体在移植后2个月达到植入阈值。这明显高于8%的植入runx1杂合子。与更高的植入一致，runx1 突变体也表现出更高的髓系嵌合现象。许多突变体表现出>90%的嵌合体，这表明血液系统几乎完全被替代。

runx1 突变体中的植入是多谱系的、持久的和连续的重新植入：移植后2个月骨髓细胞嵌合体强烈提示干细胞植入。为了进一步测试这一点，我们分析了指定长期 HSC 植入的其他特征：多谱系贡献、长期植入和连续再植入能力。为了测量其他谱系的植入，成熟的红细胞和淋巴细胞以及前体根据前向和侧向散射参数进行门控，然后确定 GFP+ 细胞的百分比。 在供体中测定了红细胞、骨髓、淋巴和前体细胞中 GFP 表达的频率。所有显示髓系植入的runx1突变体也显示出明显的红系、淋巴系和前体植入。我们观察到与髓系嵌合体相比，红细胞系、淋巴系和前体嵌合体显著降低，与供体骨髓细胞中近 100% 的 GFP 表达相比，ubi:GFP 转基因在供体红细胞、淋巴和前体细胞中的表达更低和更多异质性。与髓系嵌合体相似，与runx1杂合子相比，runx1突变体中供体对红系、淋巴系和前体细胞的贡献显著更高。unx1 突变体中的多谱系嵌合现象在长期时间点（> 6 个月）保持较高，这表明突变体能够支持长期多谱系植入。

并非所有 HSC 都是相同的。 近年来在哺乳动物造血中定义了许多具有不同谱系输出偏好的 HSC 亚型。为了评估 runx1 突变体支持的 HSC 亚型，我们分析了所有移植受者的谱系输出。尽管 ubi:GFP 转基因在红细胞、淋巴和前体细胞中的表达存在差异，这也可能导致这种异质性。为了更可靠地评估长期的多系繁殖能力，我们进行了连续移植。移植后至少6个月，来自高度植入（>70%供体嵌合体）的runx1突变体一级移植受者的骨髓细胞被移植到二级runx1突变体胚胎受者中，随后来自这些动物的骨髓细胞进行三级移植。如上所述，在移植后 2 个月对二次和三次移植受者的多系嵌合体进行检测。观察到32个二级受体中有31个具有良好的多系重组，红细胞平均嵌合值为 66% (± 21%)，髓细胞为 91% (± 19%)，淋巴为 71% (± 22%)，前体细胞为 86% (± 21%)。在三级受体中，我们观察到红细胞系 10% (± 21%)、髓系为14% (± 31%)、淋巴系为14% (± 26%)和 前体为12% (± 27%) 。为了研究谱系分布，我们检测了二级和三级移植runx1突变体的相对红系、髓系、淋巴系和前体对GFP+细胞的贡献。有趣的是，在移植的二级移植受者中，供体来源的贡献明显比一级移植受者的多，尽管这在三级移植中不再出现。

竞争性再增殖试验通常用于估计HSC频率和比较不同实验组之间的造血重建能力。我们测试了runx1突变的HSC移植是否是一个有价值的竞争性再增殖系统。从成年 ubi:GFP 和 ubi:mCherry 供体中收集供体骨髓细胞，然后以不同比例移植到 2 dpf 的 runx1 突变体中。为了确定 ubi:GFP 供体细胞中竞争性再增殖的频率，在移植后 2 个月测量了受者的 GFP 和 mCherry 嵌合现象，并确定了每个有限稀释实验组的植入频率。使用了极限稀释分析计算器，它利用植入成功率计算出每15 826个细胞中有1个干细胞的频率，这一数字与先前的研究一致，该研究估计小鼠骨髓中干细胞的频率与竞争性再增殖有关。

图 4. runx1 突变体中的竞争性再增殖揭示了高干细胞频率。

总之，我们在这里提出了一种新的HSC移植方法，可以用来测量斑马鱼的自我更新和分化能力。该模型极大地促进了在不受干扰的生态位内可视化宿主-供体细胞相互作用。结合大量转基因和突变株系的存在以及利用CRISPR/Cas9快速产生其他株系的能力，runx1移植系统可以作为发现HSC功能新调控的有力平台。

原文出自：A novel conditioning-free hematopoietic stem cell transplantation model in zebrafish - ScienceDirect