摘要：先前使用N2气体灌注斑马鱼产生缺血性中风模型；然而，由于低吞吐量该模型不是一个合适的药物筛选系统。在这项研究中，我们使用吸氧器检查了斑马鱼缺血性中风模型，以评估药物作用。缺氧暴露超过2h后可显著诱导脑细胞死亡和神经细胞损伤。为了证实吸氧器诱导的缺血模型的实用性，我们用神经保护剂治疗斑马鱼。MK-801 是一种 N-甲基-d-天冬氨酸 (NMDA) 受体拮抗剂，可显著抑制大脑中的细胞死亡，而依达拉奉是一种自由基清除剂，可显着减少死亡细胞的数量。这些结果表明 NMDA 受体的激活和活性氧的产生会诱导神经元细胞损伤，这与之前哺乳动物的报道一致。我们证明了在斑马鱼仔鱼中使用吸氧器建立缺血性中风模型的适用性，从而实现了高通量药物筛选。

关键词：斑马鱼  脑缺血  药物筛选  N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体

简介：缺血性中风是世界范围内人类发病率和死亡率的主要原因。当向大脑供血的动脉被血栓或栓塞阻塞时，就会发生这种情况。血流量的减少以及随后大脑部分缺氧和葡萄糖的缺乏会导致神经元细胞损伤和死亡。尽管对数百种药物进行了广泛的测试，如谷氨酸拮抗剂、钙通道阻滞剂和其他促生存的化学物质，但迄今为止还没有发现和批准一种有效的抗中风神经保护药物。此外，在体外和体内实验中保护缺血神经元的药物要么对人类无效，要么引起不良反应。因此，需要进一步详细的病理分析。

斑马鱼正在成为一种强大的人体疾病模型，并在药物发现的临床前阶段使用。斑马鱼的胚胎和仔鱼是光学透明的，可以在不杀死或解剖生物体的情况下检测内部器官的功能和形态变化。繁殖斑马鱼的相对容易性以及在相同条件下在紧凑空间内保持大量数量的能力进一步突出了使用斑马鱼仔鱼进行体内高通量筛选的优势。先前我们用斑马鱼仔鱼建立了缺血再灌注模型；然而，由于该模型的吞吐量较低，不适合用于药物筛选。在这里，我们开发了一种利用吸氧器诱导缺氧的新方法，以建立一种有价值的药物筛选缺血模型。

MK-801与依达拉奉药物治疗：斑马鱼仔鱼暴露于含 MK-801（10 μM、20 μM 或 40 μM）的缺氧Hank's溶液中 2 小时。缺氧后，将缺氧的汉克溶液更换为含有 MK-801（10 μM、20 μM 或 40 μM）的常氧 E3 培养基，孵育仔鱼3 小时。此外，斑马鱼仔鱼在缺氧 1 小时后用依达拉奉（一种自由基清除剂）处理。在氧吸收剂诱导缺氧后，将缺氧的汉克溶液更换为含有依达拉奉（500 μM、750 μM 或 1000 μM）的常氧 E3 培养基。

水肿：缺氧处理后，斑马鱼在常氧 E3 培养基中维持 24 小时。 然后，观察到一些斑马鱼全身水肿。测量每条斑马鱼的左眼和右眼之间的最短距离，假手术组两只眼之间的最短距离为132 μm。当距离超过132μm、 斑马鱼被判定为水肿。在 A1R-MP 共聚焦激光扫描显微镜下观察斑马鱼。斑马鱼水肿率低于 0%、64%、79%、73% 和 43%（对照、0 μM、10 μM、20 μM 和 40 μM MK-801）和 0%、57%、36% 、35% 和 30%（对照、0 μM、500 μM、750 μM 和 1000 μM 依达拉奉）。 

细胞死亡：缺氧处理后，在常氧E3培养基中培养仔鱼24h。5 dpf 仔鱼用 10 μg/mL 吖啶橙 (AO) 染色 30 分钟，并在 E3 培养基中洗涤 3 次，每次 10 分钟。共聚焦显微镜观察，仔鱼位于35mm玻璃底皿中心，包埋在1.2%-1.5%低熔点琼脂中。在 A1R-MP 共聚焦激光扫描显微镜下观察仔鱼。通过计数大脑中的绿色荧光细胞来量化细胞死亡。

图1、使用吸氧器缺氧会导致躯干和头部水肿并降低存活率。

图 2. 缺氧导致斑马鱼仔鱼脑细胞死亡。

神经细胞损伤：分别于缺氧处理前和常氧处理24h后测定Kaede的荧光强度。共聚焦显微镜下观察，斑马鱼仔鱼位于35mm玻璃底皿的中心，包埋在1.2%-1.5%的低熔点琼脂中。用A1R-MP共聚焦激光扫描显微镜测量脑白点区Kaede的荧光强度，并用NIS元素成像软件进行分析。

图 3 、缺氧导致斑马鱼仔鱼神经元细胞损伤

使用吸氧器造成缺氧性水肿：为了进行高通量筛选，选择了吸氧器对斑马鱼仔鱼进行有效的缺氧处理。缺氧处理1.5h、2h和2.5h后，斑马鱼在常氧E3培养基中孵育24h。然后，观察到一些斑马鱼全身水肿。此外，存活率以时间依赖的方式下降。

缺氧诱导大脑细胞死亡：研究了吸氧器诱导的缺氧对脑细胞死亡的影响。缺氧2h和2.5h后，脑内AO阳性细胞明显增多。2.5 h缺氧处理降低存活率； 因此，在随后的实验中，缺氧处理时间改为2h。

缺氧导致大脑神经细胞损伤：为了确定氧吸收剂诱导的缺氧对神经元细胞损伤的影响，用Tg（HuC:Kaede）斑马鱼的Kaede表达来特异性鉴定神经细胞。缺氧后Kaede的荧光强度明显降低，提示缺氧时使用吸氧器可引起脑内神经元损伤。

MK-801和依达拉奉对缺氧诱导脑细胞死亡的影响：谷氨酸的兴奋毒性在缺血性脑卒中的病理过程中起着重要作用。我们检查了 N-甲基-d-天冬氨酸 (NMDA) 受体（一种重要的兴奋性神经毒性受体）在缺氧斑马鱼模型中的参与情况。用NMDA受体拮抗剂MK-801处理斑马鱼，缺氧（2h）和常氧（3h）共5h。MK-801以浓度依赖方式降低缺氧诱导的AO阳性细胞数。这一结果提示缺氧诱导的NMDA受体的激活参与了斑马鱼神经细胞的损伤。

图4.MK-801是一种NMDA受体拮抗剂，可防止缺氧诱导的细胞死亡。

依达拉奉是一种自由基清除剂，临床上用于治疗缺血性中风。我们研究了活性氧（ROS）在缺氧斑马鱼模型中的作用，并在缺氧1h后用依达拉奉处理斑马鱼。与单独的缺氧相比，750 μM 和 1000 μM 的依达拉奉显著降低了 AO 阳性细胞的数量.

图5.自由基清除剂依达拉奉预防缺氧所致细胞死亡

讨论：我们先前在共焦激光扫描显微镜下利用N2气体灌注建立了斑马鱼脑缺氧模型。该模型是实时观察脑血流的有力工具。利用吸氧器制作脑缺血模型，建立高通量药物筛选系统。吸氧器很容易保持缺氧状态，并允许一次处理许多斑马鱼仔鱼。缺氧1.5h、2h或2.5h可引起头、躯干水肿，降低存活率。经AO染色证实，该治疗方案还诱导了脑细胞死亡。然而，AO染色很难鉴定死亡细胞的种类。用Tg（HuC:Kaede）斑马鱼观察缺氧对神经元的影响。缺氧可显著降低神经元Kaede的荧光强度。缺氧诱导脑细胞死亡，降低神经元Kaede的荧光强度。在哺乳动物模型中，缺氧会导致作用于 NMDA 受体的谷氨酸过度释放，从而引发神经元细胞损伤。MK-801，一种 NMDA 受体拮抗剂，减少了缺血性脑损伤，因此研究了 NMDA 受体在缺氧诱导的大脑细胞死亡中的参与。MK-801可降低缺氧诱导的脑细胞死亡。脑缺血再灌注后自由基的产生导致氧化应激。氧化应激可通过DNA损伤、脂质过氧化、蛋白质结构和功能的改变导致细胞死亡。依达拉奉是一种用于临床实践的自由基清除剂，因此我们试图研究 ROS 是否参与了氧吸收器诱导的细胞死亡。依达拉奉抑制缺氧后脑细胞死亡。与以往的哺乳动物实验结果一致，这些结果表明NMDA受体的异常激活和ROS的产生在斑马鱼缺氧模型中诱导了神经细胞损伤。

在该模型中，对斑马鱼仔鱼进行染色检测需要时间，使用 Tg (HuC:Kaede) 斑马鱼可以在不染色的情况下简化对缺血性神经元损伤的检测。 通过提高效率，这种斑马鱼模型可以成为开发新治疗药物的新药物评价系统。

原文出自：Establishing a high throughput drug screening system for cerebral ischemia using zebrafish larvae - ScienceDirect