小分子药物研发现状

药物研发是一个跨学科整合板块，随着各学科基础研究和科学技术的进步，对安全有效药物的需求也日益增加。从2015年-2020年，FDA共批准了245款新药物，其中小分子药物有164种，占到62%。批准小分子药物涵盖了抗肿瘤、抗感染、神经系统、自身免疫、代谢等范畴，是药物研发重点方向[1]（1. U.S. FDA Approved Drugs from 2015-June 2020: A Perspective）。一个小分子药物的发现需要化学、生物学、临床医学学科的精耕细作，从候选分子筛选到临床上市，大约需要10年时间。药物研发宗旨是安全有效，具有高投入、低产出特征，每年仅有屈指可数的药物分子通过审批，从Phase I阶段到批准上市成功率约为9.5%，尤其是抗肿瘤小分子靶向药物成功率仅为5.1%，排名最靠后[2]，如图1（Clinical Development Success Rates 2006-2015）。小分子药物成功率低主要受限于以下因素：

（1）缺乏新靶点的发现；

（2）缺乏合理和针对性的临床前评价体系和模型；

（3）易出现耐药性。 

图1. 各类疾病药物研发的成功率 

近年来，小分子药物发展更是受到了抗体药物、基因疗法、细胞疗法、ADC药物、溶瘤病毒的强势竞争，因此急需解决以上技术难题，提高小分子药物研发效率、成功率与竞争力。 

基因编辑技术简介与原理

基因编辑技术为经典和常用的分子生物学技术，在药物研发、基因治疗、基础研究、诊断技术开发等方面广泛应用。对于小分子药物研发，基因编辑可以通过基因敲入、基因敲除、碱基转换、染色重排，顺利解决上述临床前评价体系、新靶点发现、耐药性问题。 

基因编辑技术的核心是通过程序化的人工核酸酶，定点对基因组DNA进行改造。到目前为止，总共有3款基因编辑技术实现了应用，第一代锌指核酸酶 (zinc-finger nuclease, ZFN)技术、第二代转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术、第三代CRISPR/Cas9 技术，在药物研发、基因疗法、细胞疗法方面应用广泛[3]（基因编辑技术的原理及其在癌症研究中的应用），如图2所示。

图2. ZEN，TALEN，CRISPR基因编辑原理 

三代基因编辑技术各有优劣势，ZFN技术易脱靶、效率低、时间周期长；TALEN技术通量小、难以做到多基因敲除，都极大的限制了技术的应用，而第三代技术兼备通量、技术壁垒降低、成本时间耗用少优势，得到大规模应用和推广，更是获得了2020年诺贝尔化学奖，本文将以第三代CRISPR/Cas9基因编辑技术为例，详细介绍其在小分子药物研发中的应用，如表1所示。

表1. 三种基因编辑技术优劣势比较 

基因编辑技术在小分子药物研发中应用

CRISPR/Cas9本身为原核生物免疫系统抵御外来病原体的一部分，将其引入基因编辑领域，可以高效准确的进行目的基因缺失、插入、碱基替换等工作，丰富了生物科学家的技术手段。以小分子靶向药物治疗为主的肺癌、乳腺癌、血液瘤为例，该类疾病基因分型完善，标准临床治疗方案为结合分子病理分型选取相应小分子药物加以治疗，如EGFR T790M突变采用三代EGFR抑制剂奥西替尼，BRCA1/2同源重组修复缺陷变化采用PARP抑制剂，BCR-ABL融合使用伊马替尼。 

构建点突变模型

基因编辑技术可以为这类型的小分子药物研发提供临床前筛选平台。药物研发，前期都需在特异性体内外模型中进行候选分子筛选和验证。传统方法构建筛选验证平台难以模拟发病机制，建模耗时长、成功率低，而基因编辑技术可以从基因组水平编辑目的基因，可高度模拟疾病机制和进展状态，极大简化了建模流程、缩短建模周期。目前常用的EGFR常见突变、罕见突变、外显子插入细胞模型，都是根据基因编辑技术在细胞层面进行改造，如EGFR T790M、C797S、L858R、G719X、L861Q、S768I、20号外显子插入（exon20ins）等。Mi-Young Park等人[4]（Generation of lung cancer cell lines harboring EGFR T790M mutation by CRISPR/Cas9-mediated genome editing）通过CRISPR/Cas9技术构建了PC9 T790M突变增强型细胞株，在PC9原有基础上提高了T790M突变比例，并且在等量吉非替尼暴露下，PC9 T790M突变细胞株耐药性更强，但对奥西替尼敏感性更强。因此利用CRISPR/Cas9构建的点突变细胞株效率更高，更适用于三代EGFR小分子抑制剂筛选。 

构建基因融合模型

此外，基因编辑技术可进行染色体重排，为血液瘤提供疾病模型。许多血液瘤发病起源于染色体上基因重排或融合，如CML/AML（慢性粒细胞白血病/急性粒细胞白血病）与BCR-ABL基因融合相关，PDGRFα重排与CEL（慢性嗜酸性粒细胞白血病）相关，并且由于血液瘤发病进程长，疾病分子变化复杂，构建难度和疾病模拟度都需要更加成熟的技术手段。Icahn Mount Sinai大学的研究者们[5]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以多能干细胞（iPS）为载体，将AML疾病相关基因ASXL1/SRSF2/NRAS按照顺序编辑导入多能干细胞中，创建一个突变不断增加的肿瘤疾病细胞模型，可模拟AML发病全程，从早期异常血象开始，到骨髓异常增生，到后期演变为AML，便于观察各阶段转换机制。由此可见，基因编辑技术可为小分子药物研发提供更贴合实际的细胞与动物模型。该类型例子更是在代谢疾病、中枢神经系统有广泛应用。

图3. 模拟AML疾病进程转换 

图4. AML与CRISPR/Cas9实验设计方案 

发现新药物靶点

CRISPR/Cas9技术可大规模筛选药物靶点，发现新药物靶点。目前人类基因组编码的蛋白质中，约75%的靶点被认为与疾病治疗无关，而剩余25%的靶点中又有60%的靶点无法成药。目前已知的约5000个疾病分子基础中，只有250中疾病有治疗方案，因此发现药物新作用靶点对药物研发至关重要。实验人员[6]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向编码蛋白功能性区域的外显子序列，对小鼠急性髓系白血病细胞系中192个染色质功能调节区域进行了筛选，证实了6个已在研的药物靶点，19个潜在药物作用新靶点，DOT1L, EZH2, EHMT1/2、KDM1A做为MLL-AF9白血病药物靶点开发了相关抑制剂（Discovery of cancer drug targets by CRISPR/Cas9 screening of protein domains）。由此可见，利用基因编辑技术可发现全新药物作用靶点，丰富小分子药物产品管线。

图5. CRISPR/Cas9靶向编码蛋白外显子序列原理 

图6. 差异基因筛选 

协同致死研究

CRISPR/Cas9技术可作为协同致死研究手段，大规模验证基因互做关系，为小分子药物找到效应组合，达到扩增适应症、增加临床获益目的。John Paul Shen等人[7]利用CRISPR/Cas9技术编辑HeLa，A549和293T细胞系，通过测试两个靶向基因对细胞生长的影响判断两者间作用关系。研究者们共分析了73个基因，进行了141,912次交互作用分析，最后发现这73个癌基因之间的遗传关系，存在着152对协同致死效应组合。包括BRCA1/2同源重组修复缺陷指导PARP抑制剂用药，CCND1与CDK4/6抑制剂，PTEN与mTOR抑制剂。

图7. CRISPR/Cas9筛选协同致死组合 

基因编辑技术在小分子药物研发中应用广泛，涵盖小分子药物研发全流程。从候选分子筛选、药理学研究、毒理研究到转化医学都可借助基因编辑。随着技术发展，更是渗透到临床诊疗。张力教授团队在肺癌中发现新ALK融合位点，使用基因编辑技术验证了新融合组合功能和对ALK抑制剂敏感性，最后辅助患者临床用药，并获得较好临床药效。因此，伴随医学与生物学的完善，基因编辑技术在小分子药物研发中应用将在基因敲入、敲除、碱基转换基础上向外拓展，获得更多样化发展。 

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参考文献：

[1] Bhutani, P., et al., U.S. FDA Approved Drugs from 2015–June 2020: A Perspective. Journal of Medicinal Chemistry, 2021. 64(5).

[2] Mullard, A., Parsing clinical success rates. Nature Reviews Drug Discovery, 2016. 15(7): p. 447.

[3] 谢一方, et al., 基因编辑技术的原理及其在癌症研究中的应用. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2017. 08(v.24;No.119): p. 6-18.

[4] Park, M.Y., et al., Generation of lung cancer cell lines harboring EGFR T790M mutation by CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Oncotarget, 2017. 8(22).

[5] Wang, T., et al., Sequential CRISPR gene editing in human iPSCs charts the clonal evolution of leukemia. 2020.

[6] Junwei, et al., Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.