想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周二会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是NLRP3及其突变导致的家族性冷自身炎症综合征。 

NLRP3基因简介

Nlrp3基因编码一个pyrin样蛋白，蛋白包含一个pyrin结构域，一个核苷酸结合位点(NBS)结构域和一个富亮氨酸重复序列(LRR)基序。该蛋白与凋亡相关的斑点样蛋白PYCARD/ASC相互作用，PYCARD/ASC包含一个caspase招募域，是NLRP3炎症小体复合体的成员。该复合物作为NF-kappaB信号的上游激活因子，并在炎症、免疫反应和细胞凋亡的调节中发挥作用。

图1. 炎症小体的分子机制示意图[1] 

IL-1β，也称为内源性热原，是一种高度炎症细胞因子，其产生受到至少三个不同步骤的严格控制。第一步涉及pro-IL-1β蛋白（p35）的产生；随后裂解pro-IL-1β前体以产生活性 IL-1β 蛋白 (p17)，最后将 IL-1β 释放到细胞外环境中。中间步骤，即 pro-IL-1β 的加工，涉及激活 caspase-1 激活复合物，其最佳特征是炎症小体。NLRP3 炎症小体将无活性的 pro-caspase-1 加工成有活性的 Caspase-1，它将pro-IL-1β裂解为成熟的 IL-1β，导致炎症和细胞过早死亡。 

编码 Cryopyrin 的基因NLRP3的显性遗传突变被证明是导致一系列炎症疾病的原因，包括家族性感冒自身炎症综合征 (FCAS)、Muckle -Wells 综合征 (MWS) 和新生儿多系统炎症性疾病 (NOMID) ，现在统称为冷热蛋白相关周期性综合征 (CAPS)。

表1. FCAS的基本信息

备注：标有√的意为赛业红鼠资源库有该种保存状态的小鼠 

家族性冷自身炎症综合征

家族性冷自身炎症综合征 (FCAS)，是一种罕见的遗传性炎症性疾病，其特征是间歇性发作的皮疹、发热、关节痛和其他因暴露于寒冷而引发的全身性炎症的体征/症状FCAS的发病发生在婴儿期和幼儿期，并在患者的一生中持续存在。FCAS通常在常染色体显性遗传条件下遗传，并且是由编码冷蛋白(NALP3)蛋白的CIAS1/NLRP3基因中的杂合突变引起的。假设该基因的突变会导致含有冷蛋白的蛋白质复合物的活性增加。这种蛋白质复合物被称为炎症小体，可调节体内炎症。炎症小体活性增加导致称为IL-1ß的蛋白质释放增加，从而导致炎症症状，如发烧和关节痛。 

由于FCAS是一种新发现的疾病，目前很难确定该疾病的实际发病率和患病率。新生儿多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle-Wells综合征 (MWS) 症状可能与FCAS的症状相似，并且存在显著的表型重叠。家族性冷自身炎症综合征1 (FCAS1) 是由NLRP3基因中的杂合突变引起，位于染色体1q44。另外FCAS2由染色体19q13上的 NLRP12基因突变引起；FCAS3由染色体16q23上的PLCG2基因突变引起；FCAS4由染色体2p22上的NLRC4基因突变引起。

图2. 冷卟啉相关周期性综合征(CAPS)的临床谱[2] 

表2. FCAS疾病相关信息 

Nlrp3基因编辑小鼠表型

1. 点突变模型

丙氨酸 352 到缬氨酸 (A352V) 和亮氨酸 353 到脯氨酸 (L353P) 的突变分别与经典 MWS 和 FCAS 患者密切相关，而在重叠综合征患者中则不太相关。通过ES打靶技术生成两个点突变小鼠模型：Nlrp3 A350V 和Nlrp3 L351P。因内含子中Neo的存在，阻断了基因的正常表达，通过交配不同启动子下表达Cre重组酶的小鼠介导Neo在不同部位删除并表达突变基因。

图3. Nlrp3 点突变小鼠打靶策略[3] 

Nlrp3 A350V/+ / CreZ（胚胎期删除Neo并表达突变基因）幼崽在出生后 1-2 天或之前表现出炎症表型，在第 4 天出现皮肤脓肿，并出现鳞屑状红斑（图3A）。此外，这些小鼠在第 4 天表现出明显的生长延迟，缺乏色素沉着和毛发生长。Nlrp3 A350V/+ / CreL（骨髓细胞系删除Neo并表达突变基因)幼崽表现出相似的表型，但具有不同的死亡率动力学，因此这些小鼠中有 70% 存活到第 7-9 天，然后以增加的速度死亡。

图4. Nlrp3 点突变小鼠相关表型数据[3] 

虽然与 MWS 患者中观察到的荨麻疹样病变不同，但在表达 A350V 的幼崽中观察到的皮肤红斑、脓肿和鳞屑表明存在潜在炎症。突变小鼠总体白细胞计数仅轻度升高，但中性粒细胞和血小板增多是明显的。在 CAPS 患者中一致描述了类似的血液学和皮肤检查结果。来自Nlrp3 A350V/+ / CreL幼崽的发炎皮肤切片进行了 IL-1β 和 IL-6 的免疫组织化学。两种细胞因子（主要在真皮中的 IL-1β 和表皮中的 IL-6）的表达增加，与来自 CAPS 患者的皮肤活检一致，并暗示这些细胞因子在皮肤病理学中的作用。TNFα 没有显着差异，这与先前描述的 CAPS 患者一致。

图5. Nlrp3 点突变小鼠血清和皮肤中多种细胞因子上调[3] 

2. 敲除小鼠模型

通过ES打靶技术生成Nlrp3 （Cias1)敲除小鼠模型，通过在ATG起始位置处插入EGFP达到敲除的目的：

图6. Nlrp3基因敲除小鼠打靶策略[5] 

野生型、Nlrp3+/-和Nlrp3-/-巨噬细胞产生相当数量的 pro-IL-1β，然而，与它们的野生型对应物不同，Nlrp3-/-巨噬细胞在 ATP 处理后没有切割 pro-IL-1β，表明，cryopyrin 对于 ATP 诱导的 caspase-1 激活至关重要；用 LPS或 Pam3CSK4 引发的野生型巨噬细胞响应尼日利亚菌素或 maitotoxin分泌IL-1β和IL-18，相比之下，Asc-/-和Nlrp3-/-巨噬细胞均未释放显着的IL-1β或IL-18。 

CAPS的治疗

在大多数情况下，CAPS 由NLRP3基因突变引起。改变的基因产物cryopyrin激活炎症小体，导致IL-1β的过度产生。IL-1β 导致 CAPS 的炎症表现。IL-1 抑制剂是安全有效的治疗选择，随着 IL-1 抑制剂的出现，为这种破坏性疾病提供了安全有效的治疗选择。 

非甾体抗炎药常用于缓解关节疼痛。高剂量的皮质类固醇已被证明在一定程度上有效，但可能会引起短期和长期的副作用。 

Regeneron Pharmaceuticals 的 Arcalyst (Rilonacept) 是一种IL-1 阻滞剂，于 2008 年获得 FDA 批准用于治疗成人和 12 岁及以上儿童的 CAPS，包括 FCAS 和 MWS。 

诺华制药的 Ilaris (Canakinumab)，一种针对IL-1β 的单克隆抗体。2009 年被 FDA 批准用于治疗患有 CAPS 的儿童和成人，包括 FCAS 和 MWS。 

Biovitrum Pharmaceuticals 的 Kineret (Anakinra) 是一种 IL-1 受体拮抗剂，已广泛用于 FCAS 患者，临床效果极佳。然而，它目前未被 FDA 批准用于治疗 FCAS 或任何 CAPS 疾病。 

小结

未来的研究将需要解决cryopyrin中的激活突变如何规避炎症小体的正常调节以产生炎症性疾病，如家族性感冒自身炎症综合征、Muckle-Wells综合征和新生儿多系统炎症性疾病。一个有趣的可能性是低水平的细菌感染加上失调的冷热蛋白反应会引发与这些疾病相关的症状。 

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参考文献：

1. Stojanov S, Kastner DL. Familial autoinflammatory diseases: genetics, pathogenesis and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2005 Sep;17(5):586-99. doi: 10.1097/bor.0000174210.78449.6b. PMID: 16093838.

2. Sutterwala FS, Ogura Y, Szczepanik M, Lara-Tejero M, Lichtenberger GS, Grant EP, Bertin J, Coyle AJ, Galán JE, Askenase PW, Flavell RA. Critical role for NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1. Immunity. 2006 Mar;24(3):317-27. doi: 10.1016/j.immuni.2006.02.004. PMID: 16546100.

3. Kuemmerle-Deschner JB, Haug I. Canakinumab in patients with cryopyrin-associated periodic syndrome: an update for clinicians. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2013 Dec;5(6):315-29. doi: 10.1177/1759720X13502629. PMID: 24294305; PMCID: PMC3836377.

4. Brydges SD, Mueller JL, McGeough MD, Pena CA, Misaghi A, Gandhi C, Putnam CD, Boyle DL, Firestein GS, Horner AA, Soroosh P, Watford WT, O'Shea JJ, Kastner DL, Hoffman HM. Inflammasome-mediated disease animal models reveal roles for innate but not adaptive immunity. Immunity. 2009 Jun 19;30(6):875-87. doi: 10.1016/j.immuni.2009.05.005. Epub 2009 Jun 4. PMID: 19501000; PMCID: PMC2759865.

5. Mariathasan S, Weiss DS, Newton K, McBride J, O'Rourke K, Roose-Girma M, Lee WP, Weinrauch Y, Monack DM, Dixit VM. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):228-32. doi: 10.1038/nature04515. Epub 2006 Jan 11. PMID: 16407890.