胚胎干细胞(ESC)的鉴定方法
干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和成体干细胞(adult stem cell, ASC),其中ESC是来源于囊胚内细胞团的全能干细胞,初次发现于1981年,研究人员从小鼠囊胚中成功分离并实现了体外培养。因ASC是在成年动物体内的组织中分离提取,如骨髓、脂肪和脐带等,其在体外分化增殖能力有限,仅能分化为特定某几种类型组织的细胞。
而ESC具有无限的增殖传代能力及分化全能性,可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型。这种无可比拟的特性让ESC成为很多领域的基础和应用研究的强有力工具,包括发育和调控研究、再生医学、潜在治疗方法。
那么ESC具有什么形态学特征?它有哪些表面标志物?又该如何鉴定其分化潜能呢?请看以下分解。
01
形态学
相对其他细胞,ESC单个细胞个体小,细胞核大,体外培养时呈集落样或克隆样生长,克隆内细胞排列紧密,细胞集落有明显的边界。此特有的形态学特征常用来做初步鉴定ESC的方法。
例如,Mouse ESC细胞核大,胞核内有多个核仁,核浆比高。在贴壁生长的情况下,Human ESC集落与Mouse ESC不同,呈相对松散、扁平状集落,集落内细胞界限隐约可见。
Mouse ESC 40x
02 特异性转录因子/抗原表达
ESC鉴定也有独有的表面标志物,目前常用的检测标志物是特异性转录因子OCT-4、Nanog及阶段特异性胚胎表面抗原SSEA。
OCT-4是一个和胚胎发育全能性相关的转录因子,几乎所有的ESC都表达OCT-4,当ESC被诱导向成体细胞分化时,OCT-4的表达逐渐下降。
Nanog是一种有同源结构域的转录因子,可以维持ESC的自我更新,以及调节ESC的细胞周期。与OCT-4相似,当ESC分裂旺盛时,Nanog高表达,随着ESC分化程度的提高而Nanog表达量逐渐下调。
SSEA是一种糖酯蛋白,用来鉴定ESC的SSEA通常有三种,分别是:SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4,它的表达具有种属间特异性。如通过免疫荧光检测,可发现Human ESC和Mouse ESC具有不同的SSEA表达。
Human ESC的鉴定
高表达OCT-4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4;
低表达SSRA-1。
Mouse ESC的鉴定
高表达OCT-4、Nanog、SSEA-1;
低表达SSEA-3、SSEA-4。
03 染色体结构
对ESC进行染色体核型分析,方法与成体细胞无异,总体上程序一致。ESC在体外扩增培养后仍维持正常二倍体核型,不随传代次数而改变。镜下观察Mouse ESC,细胞核型仍然保持正常,核型为40,XX/XY。
04 分化潜能
不同于其他干细胞,ESC具有无限增殖能力,是公认的全能干细胞,在一定条件下具有分化为胚胎的外、中、内三个胚层细胞分化的能力,理论上可以诱导为机体内各种类型的细胞,如可分化为神经干细胞、造血细胞、软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞等。正是由于ESC具有可塑性和无限增殖的特性,使其成为再生医学和组织工程研究的热点。
拟胚体(EB)的形成是ESC分化的主要步骤。在缺少小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层的情况下,ESC经EB形成培养基的刺激会自发分化形成三维聚集体,这种结构有利于细胞的相互作用,比如细胞间的接触和间隙连接的建立。
另外,ESC还能在体内实验形成畸胎瘤,将其注射至免疫缺陷小鼠观察是否产生畸胎瘤,若畸胎瘤含有三个胚层来源的细胞,则可说明ESC具有体内分化的潜能。这种畸胎瘤还能维持稳定的二倍体,无恶性病变。
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