近日，中南大学湘雅医院产科张卫社教授、戴镭博士后领导的产前诊断研究团队在美国肾病学学会官方期刊《Journal of the American Society of Nephrology》上发表了题为“A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans”的文章，影响因子10.12，为国际上首次发现肾连蛋白（NPNT）基因是导致人类双肾缺如的致病基因。戴镭博士后为论文独立第一作者，张卫社教授为论文独立通讯作者。

先天性肾尿路畸形是一种常见的出生缺陷，新生儿的发病率约为2/1000，在所有儿童先天性畸形中占30-40%。双肾缺如（BRA）则是先天性肾尿路畸形中最严重的类型，通常会导致围产期死亡或终止妊娠。尽管人们认为遗传因素扮演了重要角色，但仍有大部分病例的确切原因得不到诊断。 

全外显子组测序发现NPNT突变

在该研究中，一对近亲夫妻连续三次妊娠都显示双肾未显示、羊水过少，怀疑胎儿患有双肾缺如而不得不引产，并通过引产胎儿的病理解剖得到证实。为了确定这背后的遗传因素，研究人员对这个家庭中的多名成员开展全外显子组测序（WES）（图1）。

图1. NPNT突变的家族谱系图 

研究人员发现在两个异常胎儿共享了35.05 Mb的基因组区域，并从那些共有的连续性纯合片段（ROH）中发现了310个变异。在去除了InterVar预测为良性和可能良性的变异后，剩下NPNT基因第8个外显子中的纯合移码突变（c.777dup/p.Lys260*）。因此研究人员认为，NPNT可能是导致双肾缺如的第一候选基因。 

肾连蛋白（Nephronectin，NPNT）对肾脏发育至关重要，小鼠中Npnt的敲除往往会导致肾缺如或发育不全。因此，NPNT被认为是双肾缺如的可能致病基因，但以往的研究NPNT突变并未在肾发育不全患者中报道。研究人员通过软件预测，移码突变可能导致下一个密码子形成终止密码子，从而产生截短蛋白，只有260个氨基酸。该预测通过体外过表达实验得到了证实。 

在过表达WT-NPNT和K260ter-NPNT的HEK293T细胞中，研究人员发现K260ter-NPNT mRNA表达水平显著低于野生型对照。使用Flag标签抗体的Western blot分析在K260ter-NPNT转染细胞中检测到35 Kda的截短蛋白，且表达量降低，而针对突变下游表位的NPNT抗体则没有检测到截短蛋白，与预期一致（图2）。这些结果证实，p.Lys260* 突变导致无义介导的mRNA降解和截短蛋白的产生。

图2. WT-NPNT和K260ter-NPNT在293T细胞中的过表达 

Npnt突变小鼠显示肾发育不全

研究人员委托赛业生物，构建了带有Npnt-c.777dup/p.Lys260*突变的基因敲入小鼠，并通过杂合小鼠的交配产生纯合突变体（NpntK260*/K260*）。利用Npnt抗体对纯合小鼠的肺组织开展WB分析，未检测到任何NPNT蛋白（图3），表明引入小鼠模型的突变影响了Npnt蛋白的表达，与人类相似。

图3. 模拟纯合移码突变的基因敲入小鼠的构建

所有小鼠出生时都有着正常的外观（大小、体重且无外部缺陷），但纯合小鼠在出生后第二天死亡。研究人员解剖后发现，绝大多数纯合小鼠的两侧都没有肾脏（14/15），伴随着输尿管的缺失；剩下的一只NpntK260*/K260*小鼠有两个尺寸较小的原始肾脏。组织学分析显示，纯合原始肾脏中的肾单位发育停滞，而其他组织没有明显的形态异常。 

有意思的是，NpntK260*/K260*小鼠与Npnt−/−小鼠的表型存在一些差异。NpntK260*/K260*小鼠的双肾缺如频率高达93.3%，而以往报告的Npnt−/−小鼠频率为46%。作者认为，可能的原因在于另一种配体在功能上补偿了Npnt−/−小鼠缺失的Npnt蛋白。在NpntK260*/K260*小鼠中，截短的Npnt蛋白残基可能对替代配体产生负面影响。另一种可能的解释是遗传背景不同，近交系小鼠表现出较低的性状可变性。 

总结

这项研究表明，该患病家庭中出现的双等位基因功能缺失NPNT突变是造成人类双肾缺如的原因。模拟该突变的小鼠模型再现了双肾缺如的临床表型。这些结果揭示了双肾缺如的新致病基因，为双肾缺如家族的遗传诊断、产前诊断和胚胎植入前诊断提供了新的靶点。 

产科主任张卫社教授领导的中南大学湘雅医院产前诊断中心经四年建设，已成为中南地区技术力量最强、开展产前诊断项目最多的省级产前诊断中心之一。中心致力于复杂胎儿宫内异常诊治，罕见病的遗传学诊断、产前诊断及科研工作，每年接待大量的疑难会诊及转诊工作，为降低湖南省及周边省市地区出生人口缺陷率，提高缺陷儿的救治率，挽救珍贵儿的生命起到了关键作用。 

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原文检索：

Lei Dai, Jingzhi Li, Liangqun Xie, et al. A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans. JASN August 2021, 32 (8) 1871-1879; DOI: https://doi.org/10.1681/ASN.2020121762