摘要：血管成形术引起的血管损伤引发的各种机械和生物过程的相互作用导致再狭窄过程。因此，早期动脉回缩、负性血管重塑和新内膜形成限制了介入再通术的长期通畅性。其中最严重的是新生内膜增生，可追溯到4种主要机制：内皮损伤和激活；内膜下间隙单核细胞聚集 成纤维细胞迁移； 以及血管平滑肌细胞的转化。存在多种动物模型来研究潜在的病理生理学。 尽管小鼠模型易于遗传操作，可以实现以细胞和分子为重点的基础研究，大鼠可实现高通量支架和球囊模型，但两种啮齿动物都缺乏与人类相当的脂质代谢。相反，兔子建立了一座桥梁，缩小了基础研究和临床研究之间的差距，因为它们的脂质代谢类似于人类，而且体型大小可以使用临床血管成形术。动物、饮食和损伤模型的每一种不同组合都有不同的优缺点，选择合适的模型需要了解从血管形态到不同的细胞和分子特征的物种特有生物学特性。

关键词：血管成形术  动物模型  内膜增生  再狭窄

心血管疾病目前是导致死亡的主要原因。心血管疾病最常见的发病机制是动脉粥样硬化，它被认为是一种多因素引起的慢性进行性炎症性疾病，长期失去通畅性，主要影响冠状血管、颈动脉和外周血管系统。经皮腔内介入治疗成功率高，围手术期并发症少，已被用于管腔狭窄的动脉粥样硬化的对症治疗。尽管技术上取得了良好的成功，但在前 12 个月内仍有高达 20% 的复发率，因血管区域而异。尽管有多种治疗方法，例如在血管成形术期间通过药物洗脱球囊和/或支架将抗肿瘤药物输送到血管壁，但新内膜增生过程限制了持久的成功，这是导致中期通畅性丧失的主要原因。新内膜的形成与新生动脉粥样硬化的形成有若干相似之处。血管创伤引发炎症反应，增加免疫细胞的募集，尤其是单核细胞和巨噬细胞，它们迅速积累并分化为泡沫巨噬细胞。氧化应激和细胞因子和趋化因子的释放增加导致血管平滑肌细胞（VSMC）从中膜向内膜增殖和迁移。各种生长因子进一步刺激新生内膜的形成。再狭窄可发生在支架或球囊血管成形术后，以及与血管损伤相关的其他血管重建术后。尽管使用药物洗脱技术后再狭窄的发生率降低，但已观察到再狭窄。差异主要表现在再狭窄发生的频率和时间上。为了了解潜在的病理机制并开发新的治疗方法，动物模型已成为越来越重要的工具。基本病理生理学和新的治疗方法可以通过这种方式进行研究。新生内膜增生模型主要通过3 种不同的方法诱导：1) 手术干预； 2) 代谢诱因； 3) 特殊培育或转基因生物。此外，还有许多不同的物种可供选择——啮齿动物、兔、犬、猪、反刍动物、灵长类动物，甚至鸟类都可以用来研究再狭窄和新生内膜增生的机制。由于再狭窄的病理生理学以及治疗干预的效果存在重大的种间差异，因此需要了解不同动物模型中动脉粥样硬化和新内膜形成的知识。这篇综述强调了新内膜增生是再狭窄的基本病理机制，重点介绍了各种动物模型的物种特异性特征及其对转化研究的影响。

新生内膜增生小鼠模型：在过去的几十年里，小鼠已经成为应用最广泛的科学模型动物。此外，小鼠的免疫系统与人类的免疫系统相当，尤其是在血管疾病的炎症反应方面。然而，与人类相比，大多数小鼠模型没有管腔狭窄和斑块破裂，这是人类动脉粥样硬化的特征。小鼠心血管系统的显微解剖与人类相比存在一些关键差异。动脉内膜由内皮层组成，覆盖在内部弹性层上，没有额外的结缔组织或血管平滑肌细胞。此外，因为缺少厚纤维帽动脉粥样硬化斑块的形态也很不同。这些新血管来源于血管滋养管，在人类中血管是免疫细胞的通道，并有助于慢性炎症和坏死核心的形成。因此，有不同的 “人性化”小鼠的免疫炎症系统，以实现更多的可翻译模型。尽管如此，作为一种科学模型，最重要的优点是它易于进行基因操作。由于不同的脂质代谢和脂质蛋白质组对心血管疾病具有很高的抵抗力，因此不可避免地使用近交或转基因小鼠来研究动脉粥样硬化和新生内膜增生。尽管人类的大部分血浆胆固醇是以低密度脂蛋白（LDL）的形式携带的，但小鼠是以高密度脂蛋白（HDL）的形式携带的。原因是小鼠缺乏胆固醇酯转移蛋白（CETP），该蛋白将胆固醇酯从高密度脂蛋白传递到含有载脂蛋白B的脂蛋白，如人类的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白（VLDL）。其他重要的差异在于载脂蛋白结构、均质 HDL 以及巨噬细胞缺乏 VLDL 受体。小鼠的肝脏活动也会阻止动脉粥样硬化的发展：小鼠具有高肝脏 LDL 受体活性； 循环中高水平的肝脂肪酶； 胆汁酸排泄量高。因此认为不可能仅通过饮食方式在野生型小鼠中引发可转化动脉粥样硬化。

由于上述原因，存在不同的近交系和转基因小鼠模型。最常用的修饰是载脂蛋白E和低密度脂蛋白受体（LDLr）基因敲除小鼠。最常用的品系是C57BL/6、C3H/HeJ、FVB/NJ、129/SvJ和BALB/C。ApoE是一种主要在肝脏合成的糖蛋白，在乳糜微粒和VLDL的分解代谢中起着关键作用。它作为载脂蛋白E受体或LDLr的配体，介导肝脏和小肠中这些物质的细胞摄取。ApoE 缺陷型 (ApoE-/-) 小鼠显示出较高的血浆总胆固醇水平，并在正常饮食下发展为动脉粥样硬化，而喂养西式高脂肪饮食可显著增强动脉粥样硬化。ApoE 的缺乏显着影响炎症过程，从而影响转化潜力。ApoE的组合模型−/− 如下文所述，采用动脉结扎方法的小鼠会导致新生内膜的形成，在某些方面与人类的情况相当。LDLr存在于几乎所有动物细胞膜上，介导LDL的内吞作用。缺乏这种受体的 LDLr-/- 小鼠在西方饮食中仅显示血浆胆固醇水平显著增加。它们产生类似人类的脂质特征，而炎症反应不受影响。

颈动脉结扎模型：远端分叉附近的颈总动脉结扎导致血流中断，导致富含VSMC的新生内膜形成，并在2-4周内发生广泛的血管重塑和血管直径减小。在几周内可以连续观察到新生内膜病变的细胞减少和细胞外基质积累增加。对侧颈动脉可作为阴性对照，并随着直径的扩大进行代偿性重塑，而结扎后 3-4 周可在每侧检测到基因表达的变化。该模型的其他方法通过结扎颈外动脉、颈内动脉或双侧颈动脉，而不触及颈总动脉，应用不完全血流中断。这些模型的优点在于良好的手术可行性和高重复性。此外，机械损伤和炎症反应有限，而内皮细胞基本上保持完整。

肩袖损伤模型：为研究特异性内皮介质的作用，发明了肩袖诱导小鼠新生内膜形成的模型。为小鼠发明肩袖诱导新生内膜形成模型研究特定内皮介质的作用。在这个模型中，一个小的聚乙烯肩袖通过血管周围的收缩对血管壁造成创伤，血管周围的收缩仍然会损伤血管，但损伤程度较轻，没有内皮剥脱，同时只导致灌注管腔狭窄而没有完全阻塞。新生内膜主要由 VSMC 组成，其似乎主要由 PDGF 家族的释放和细胞外基质物质存在而诱导。其他方法是通过放置一个包含锥形内腔的肩袖来建立的，这会产生不同的血管直径，从而引起特定的剪切应力、振荡和血流速度的变化，从而导致高脂血症小鼠动脉粥样硬化的形成。作为一个，该技术优势是减少出血和血栓形成率，死亡率较低，并且相对容易复制。在时间和成本上也相对经济。内皮细胞基本保持完整，可以在分子水平上进行研究其参与动脉粥样硬化和新生内膜形成的情况。

线损伤模型：这种血管内扩张和内皮剥脱模型最初在颈动脉上进行，现在主要用于股动脉和髂动脉。小鼠10至16周龄，在技术难度（动脉太小）和再现性（新内膜形成的变异性增加）之间找到平衡。必须首先暴露动脉，然后在 2 个结扎线之间切开切口（近端立即收紧以避免失血，远端在内皮剥脱后结扎），在那里插入导线。金属丝的直径可达血管直径的 3 倍，并且在 1 分钟内不移动以确保过度拉伸。然后将金属丝旋转或前后移动，使内皮几乎完全去除，中间层的细胞也部分受损。随后结扎血管。因为受损的血液流动也会限制细胞从循环到血管壁的迁移。之后可以直接检测血小板粘附和 VSMC 损伤，并且可以在 1 周内观察到新内膜形成的开始。 经过不断演变，主要由 VSMC 组成的同心同质新生内膜病变在 3-4 周时形成，并在大约 8 周时停止。该模型非常适合模拟球囊血管成形术造成的创伤，同时可以维持恒定的血流量。它为研究血管成形术后再狭窄提供了一个成熟的选择，如血管平滑肌细胞对剥脱的反应，炎症和血栓程度较低。

静脉移植模型: 该研究工具旨在研究旁路移植物中新生内膜增生和再狭窄期间发生的病理生理反应。将供体动物的颈静脉或1条腔静脉移植到试验动物体内，并与颈动脉或股动脉端对端、端对侧吻合，或与静脉补片吻合，以修复较大的血管缺损。在这种情况下，新内膜的形成不一定是负面的。 由于对移植物的新要求，较薄的静脉壁必须加强以承受改变的压力和流量。然而，如果这种重塑过程超过一定程度，伴随着动脉粥样硬化病变的发展，就会观察到血流限制性再狭窄。该模型基本上类似于人类静脉移植的力学特性和并发症。

大鼠新生内膜增生模型: 球囊损伤模型: 由于其体积比小鼠大，因此可以在大鼠主动脉中模拟球囊血管成形术后再狭窄的发展。，颈动脉是最常用的。为避免出血，应放置肩袖或结扎带。然后插入球囊（使用2-F Fogarty导管）并在选定位置扩张，以引起过度伸展。充气球囊向前和/或向后运动可导致血管壁完全剥脱。在内皮剥脱后的几天内可以检测到初始富含 VSMC 的新内膜形成，并且可以在 2 周内可靠地观察到，在 21 天达到其平台期。，在大量的模型动物中以相对较低的成本和支出模拟可以建立上述模型。该模型具有很高的再现性。

支架内再狭窄模型：该实验设置在大鼠中建立，以评估具有更高吞吐量的模型中的标准人体尺寸支架。结合 ApoE 缺乏等高致动脉粥样硬化品系，该模型可以可靠地用于研究临床相关的支架内再狭窄。该过程类似于球囊损伤模型，但通过在受伤血管中放置支架进行升级。标准动脉是主动脉，可通过颈动脉、经腹或经髂血管到达。由于血栓形成率降低，使用髂动脉作为主动脉支架置入点可提供更高的存活率。28天后，可以观察到明显的支架内新生内膜形成，主要由血管平滑肌细胞和细胞外基质组成。使用 ApoE-/- 大鼠可使再狭窄的发展加剧 30%-40% 以上。

兔内膜增生模型：尽管人类与小鼠或大鼠之间的基因匹配度很高，但小鼠的代谢与人类存在显著差异，限制了转化潜力。相比之下，兔在新药和诊断方法的研究中提供了很高的转化能力，并且在啮齿动物的基础研究和更大动物的转化研究之间搭建了一座桥梁。

损伤模型：尽管高脂饮食的兔子迟早会自行形成自发性动脉粥样硬化，但通常会进行诱导干预以加速再狭窄和新内膜病变的形成。血管损伤的手术执行与大鼠和小鼠的手术执行几乎没有区别，但更有趣的是血管成形术的方法与人类执行的程序相似。这使得球囊和支架损伤模型在兔中特别有趣，因为重点是可翻译转化性。一种进入兔心血管系统的优雅方式是使用 Seldinger 技术与微导管相结合，通过耳廓中央动脉或耳外静脉进入。在球囊损伤与致动脉粥样硬化饮食相结合的模型中，可以在 7-10 天开始观察到动脉粥样硬化斑块的发展，而在 6-10 周后，出现管腔变窄的狭窄病变。与人类非常相似，可以在组织学和分子水平上检测到新内膜的形成。在支架损伤与高胆固醇饮食相结合的模型中，支架内再狭窄与新内膜形成在 1 个月内发生。动脉内膜切除术中再狭窄的检查也可以在兔进行。 在兔颈动脉内膜切除术模型中，7天后出现新生内膜形成，炎症细胞因子与血管再狭窄直接相关。

图1、兔模型再狭窄的示范性诱导

新生内膜增生的大型动物模型：由于技术上的可行性和相当好的临床可转化性，已经建立了许多大型动物模型。 除了小型反刍动物，主要包括猪、狗和非人类灵长类动物。这些模型的转化潜力尤为重要。然而，使用此类动物也会显著增加审批过程中的工作量、成本等，几乎不可能实现高通量和基因操纵。

犬：由于犬的体型、可用性、相对较低的成本以及易于处理和护理，所以很早使用犬模型。它们对动脉粥样硬化和新生内膜增生的发展具有天然的相对抗性，这导致狗在可转化性方面是一个不合适的模型。除非同时出现甲状腺功能减退症，否则饮食诱导动脉粥样硬化几乎是不可能的。主要原因是犬缺乏CETP及其凝血系统，该系统提供高纤溶活性。此外，犬的中膜增厚，通常只形成一层薄薄的新内膜层，没有明显的管腔狭窄，而较小的动脉是主要受影响的血管。在冠状动脉、静脉移植物、颈动脉的不同损伤模型中，在2周的时间内观察到新生内膜的形成，但其强度仍然适中，几乎不受血管损伤程度的影响。

猪：在临床前研究中猪被证明是有效的。其体型大小和/或体重相当，具有相似的体型和/或体重、相似的自然饮食，因此具有与人类相当的代谢和脂质特征。 此外，猪的心血管系统在解剖学和生理学上与人类相似。即使在正常饮食条件下，猪也可以在4到8年内形成与人类相当的动脉粥样硬化斑块。此外，不仅在形态上相似，而且在沿动脉树的病变分布方面也相似。重要的区别是猪体内缺乏脂蛋白（a）和不同的CETP活性。因此，高胆固醇水平和在饮食中添加胆酸是诱发加速动脉粥样硬化和其他心血管疾病所必需的。使用特殊的繁殖系、疾病或损伤模型，可以可靠地激发快速病变发展和新生内膜形成。猪已成为在糖尿病或家族性高胆固醇血症等病理前提下模拟和研究动脉粥样硬化发展的可靠工具。利用Rapacz或遗传性高低密度脂蛋白和高胆固醇血症猪，针对自然突变的ApoB和LDL基因选择培育了一种猪品系，即使在正常饮食条件下也能产生高水平的LDL，猪在2-4年内会出现类似人的动脉粥样硬化病变。这使研究人员能够在更缓慢和更现实的过程中跟踪一种在许多方面类似于人类的动脉粥样硬化的动力学。

非人灵长类：作为人类的近亲，猴解剖学和新陈代谢与人类相似，是合适的动物模型。然而，最大的问题来自于实验动物伦理，并且极具争议。尽管如此，猴也提供了很高的转化潜力。 心血管疾病的病程以及病变的发展与人类大体相似。尤其是在长期研究领域，猿类因其长寿而特别适合。例如，恒河猴在食用富含胆固醇的致动脉粥样硬化饮食后，几年内就会出现复杂的类人动脉粥样硬化病变。对于加速动脉粥样硬化的研究，球囊损伤模型主要用于动脉粥样硬化食蟹猴。

动脉粥样硬化疾病的性别差异：雌性性激素提供独特的动脉粥样硬化保护特性，大多数哺乳动物物种都保留了这些特性。 雌激素影响脂质分布、纤维蛋白原水平和一氧化氮水平，从而影响血管壁的反应性。在对 LDLr-/- 小鼠的研究中，与雄性相比，雌性发生了更严重的高脂血症和动脉粥样硬化。在ETB受体缺乏、球囊损伤的大鼠中，雄性和雌性的新生内膜形成水平相同，不受激素的影响。此外，对超过200只导管损伤的尤卡坦小型猪的汇总数据进行的荟萃分析显示，血栓形成、新内膜形成或管腔阻塞方面没有明显的性别差异，但发现药物释放后纤维蛋白沉积分解的组织形态学指标和炎症程度存在显著差异。性别作为动物模型中的生物影响因素必须纳入研究考虑；

斑块形成的物种特异性生物学差异：为了正确理解和选择特定研究问题的特定动物模型，了解不同物种间与新生内膜增生相关的生物学差异非常重要。不同物种不仅在生理和生物学特性上存在明显差异，甚至不同的亚种和繁殖系在新生内膜形成过程中也可能存在明显差异。一个特别影响转化研究领域的普遍问题是，这些确切差异尚未得到充分研究。下面总结了有关新内膜形成的已知物种特异性特征。

血管壁结构：首先在研究新生内膜增生时必须考虑到血管树上存在显著的结构变异。不同的血管区域具有不同的血流动力学和不同的动脉壁组成。这方面的一个例子是动脉内从靠近心脏的弹性型到远离心脏的肌肉型的变化。众所周知，各种动物的动脉壁结构不同。

内皮细胞：不同物种的内皮细胞显示出明显的表型差异。 这涉及形态学问题，例如基底层的突出，以及细胞代谢和信号传导机制。此外，不同物种的细胞在受体、MHC 抗原或其他蛋白质和酶方面存在差异。

VSMCs: 关于VSMC生物学中的物种特异性差异知之甚少。小鼠和猪的血管平滑肌细胞在机械性内皮剥脱术后开始增殖和迁移，持续2-3周，而人类和兔子的血管平滑肌细胞仅在5-7天后开始迁移，并持续迁移3-4周。

单核细胞和巨噬细胞：众所周知，不同物种中存在不同的单核细胞亚群，它们可以通过不同的表面标志物表达来区分，并且在动脉粥样硬化和新生内膜增生中发挥不同的功能。研究表明，不同品种的猪的单核细胞亚群是不同的，在小鼠和人类中，已经描述了另一种中间类型的单核细胞。

中性粒细胞：尽管人类血液中有40%-70%的中性粒细胞，但最新研究表明，它们对动脉粥样硬化的作用明显小于小鼠，小鼠只有10%-25%的中性粒细胞。虽然小鼠动脉粥样硬化斑块中的数量很少，但中性粒细胞可以分泌大量的细胞外基质降解弹性蛋白酶。这个事实仍然需要在更大的动物和人类中进行探索。

血小板：血小板在不同物种之间表现出巨大的差异，从大小和形状到不同的生物物理行为。血小板的大小与物种体型大小无关。小鼠、大鼠和豚鼠的血小板体积约为 3.2-5.4 fL，其血小板最小。犬和猪的血小板中等，约为 7.6-8.3 fL，而猫的血小板最大，约为 15.1 fL，人血小板的平均血小板体积为 7-12 fL。在不同的物种中，血小板对各种聚集因子的反应不同。此外，不同物种的血小板在某些结构成分上有所不同。

结论：尽管动物模型提供了关于再狭窄的详细知识，但新生内膜增生反应的巨大可变性损害了临床可转化性。不同因素的顺序和权重，如机械应激、内皮通透性、单核细胞流入、VSMC 增殖和迁移，以及细胞外基质的合成，需要进一步研究。为此，有必要了解相应动物模型的具体特征和显著差异。

原文出自：Animal Models of Neointimal Hyperplasia and Restenosis: Species-Specific Differences and Implications for Translational Research - ScienceDirect