常用移植性动物肿瘤模型
可以通过在宿主间播种移植生长,具有稳定的成活率、生长速度和自然消退率,宿主间表现大体相同的机体反应和生存时间的一类肿瘤称之为移植性肿瘤。这是目前在实验肿瘤研究中应用最为广泛的一类肿瘤模型,具有自发性和诱发性肿瘤模型无可比拟的优势。目前肿瘤化疗所应用的大多数药物,都是经以动物移植性肿瘤为对象的药效学试验而被发现,因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用的动物肿瘤模型。
移植性肿瘤模型主要是通过自发性和诱发性肿瘤来形成,从原发肿瘤到可以在宿主间播种移植生长并具有稳定成活率等上述特点的可移植性肿瘤模型需重复传代20代以上。一个成功的移植性肿瘤模型应具备移植重现性好,实验技术普通易于推广,对实验条件要求相对宽松便于应用,宿主可产生足够大的肿瘤体积和维持足够长的荷瘤寿命以利于实验的完成等条件。
移植性肿瘤模型的优点在于:可以在较短时间内批量地生产同样的肿瘤用于实验研究;这些肿瘤生长速率较一致,个体差异较小,接种成活率近100%;对宿主的影响类似,易于对研究结果进行客观评价;且可在同种属或同品系动物中连续移植,长期保留供试验之用;试验周期一般较短。因此当前抗恶性肿瘤新药筛选中实体型、腹水型癌和白血病等移植性肿瘤模型均被广泛使用。缺点是这类肿瘤生长速度快,增殖比率高,体积倍增时间短,这些都是与人体肿瘤的显著不同点;另外由于原位接种实验操作上的困难,实验中多采用常位(腋下)接种,更产生了与人实体肿瘤的差别。尽管如此,移植性肿瘤模型仍然是当今实验肿瘤研究最有利的工具之一,现在世界上保有近500种的动物移植性肿瘤模型,大多数为小鼠肿瘤,较常用的有近30种。
10.3.1肉瘤
1.小鼠S-180
小鼠S-180是实验肿瘤学中最为经典的动物肿瘤模型之一,在抗肿瘤新药体内筛选中应用十分广泛。药物筛选之初一般采用3种瘤株的组合,国内多为肉瘤、腹水型癌和白血病,S-180常为首选。宿主多用体重18~22g的昆明小鼠,肿瘤生长有实体和腹水两种形式,可以单一形式传代或腹水、实体互转。实体瘤最佳生长期为7~9d,瘤重2.5~4g。无菌条件下取生长良好的肿瘤组织,置于玻璃组织匀浆研磨器中,加适量生理盐水研磨成瘤细胞悬液,置冰浴中备用,接种部位为右腋皮下;腹水瘤最佳生长期为6~7d,存活期为10~14d。无菌条件下抽取腹水,生理盐水洗涤后稀释,接种于腹腔。实体或腹水接种瘤液细胞浓度常规为(1~2)×10的7次方/ml,接种体积为每只0.2ml。
2.小鼠S-37
小鼠S-37是小鼠肉瘤的移植性模型,宿主采用昆明小鼠,其接种方法和肿瘤生长特性与小鼠S-180近似。
3.大鼠瓦克癌肉瘤Walker-256
Walker-256起源于1928年,自一个怀孕大鼠乳腺部位自发生成,宿主可用Wistar或Fisher体重55~65g大鼠,肿瘤生长有实体和腹水两种形式并可互转,接种部位实体位于皮下或肌肉内,肌肉接种可用于建立癌骨侵袭模型。实体瘤最佳生长期肌肉为7~9d,瘤重3~6g;皮下为12~14d,瘤重5~12g。腹水瘤最佳生长期为6~7d,存活期10~14d。实体或腹水接种实验操作及瘤液细胞浓度参照小鼠S-180。
10.3.2消化系统肿瘤
1.小鼠前胃癌FC
小鼠前胃癌FC是国内于20世纪70年代建立的可移植性小鼠前胃鳞状细胞癌模型,宿主为615近交系小鼠,实体型生长,最佳生长期30~35d,瘤重2~3g。瘤组织块(每块2~3mm3,植入右腋皮下,每只1~2块)接种成功率达100%,也可于无菌条件下取生长良好的肿瘤组织,置玻璃组织匀浆研磨器中,以1:(2~3)(w/v)加入生理盐水研磨成瘤组织匀浆,接种于小鼠右腋下,接种体积每只0.2ml。
2.小鼠结肠癌C26、C38
宿主为BALB/c近交系小鼠,接种部位常于右腋皮下,实体型生长,最佳生长期7~10d,瘤重2~3g,接种物用瘤细胞悬液制备及接种体积同前。
3.小鼠肝癌H22
宿主常用昆明小鼠,肿瘤生长有实体和腹水两种形式,可以单一形式传代或腹水、实体互转。实体瘤最佳生长期为7~9d,瘤重2~4g。腹水瘤最佳生长期为6~7d,存活期10~14d,接种用瘤细胞悬液制备及接种体积同前。
4.小鼠肝癌实体型HepS和腹水型HepA
肿瘤生长特性及接种操作同小鼠肝癌H22,腹水型瘤细胞接种于小鼠脾包膜下或脾血窦内可建立脾内移植肝转移模型。
10.3.3呼吸系统肿瘤
1.小鼠Lewis肺癌
Lewis于1951年在未经处理的 C57BL小鼠肺上发现了未分化上皮样癌,而后建立了世界上第一例由小鼠自发性肿瘤形成的实体型移植肿瘤模型。该模型在同系小鼠移植成活率高(>95%)且恶性程度高,宿主为C57BL/6或BDF1近交系小鼠,接种部位常为右腋皮下,实体型生长,最佳生长期10~12d,瘤重2~3.5g。肿瘤皮下生长对药物敏感性较低但可自发性肺转移,因此常用于抗肿瘤转移试验。接种用瘤细胞悬液制备及接种瘤液细胞浓度同前。如用于某些效价强度较低的药物(如未纯化的植物药有效成分或多糖类)筛选,可采用降低瘤细胞数量[每只(3~6)×100000/0.02ml]接种于小鼠足趾皮下,以提高试验敏感性。
2.小鼠肺腺癌LA-795
可移植性小鼠肺腺癌LA-795是由1979年5月自发于近交系小鼠T-739左肺叶上的实体瘤建立,病理组织学检查属乳头型肺腺癌。宿主为T-739近交系小鼠,接种部位常为右腋皮下,实体型生长,最佳生长期18~20d,瘤重2.5~4g。该模型自发性肺转移率达100%,因此常用于抗肿瘤转移试验。接种用瘤细胞悬液制备同前,接种瘤液细胞浓度常规为(1~2)×1000000/ml,接种体积每只0.2ml。
10.3.4其他部位肿瘤
1.小鼠脑未分化型胶质瘤G422
小鼠G422是国内于20世纪60年代通过甲基胆蒽在昆明小鼠颅内诱发而建立的可移植性小鼠脑未分化型胶质瘤模型,宿主常用昆明小鼠,也有文献报道使用615近交系小鼠。实体型生长,最佳生长期10~12d,瘤重2.5~4g。于无菌条件下取生长良好的肿瘤组织,置于玻璃组织匀浆研磨器中,以1:(2~3)(w/v)加入生理盐水研磨成瘤组织匀浆过滤,瘤细胞浓度(1~2)×10的7次方/ml,接种于小鼠右腋下或后肢肌腹内,接种体积每只0.2ml。如实验需要也可接种于颅内,以小鼠前颅矢状缝和右人字缝交叉处向右外2mm为穿刺点,垂直于颅骨穿刺,进针约2mm后,将悬液缓慢注入右顶叶内,接种量(1~2)×10的7次方/ml。
2.小鼠宫颈癌U14
小鼠宫颈癌U14是以国内20世纪60年代甲基胆蒽异位诱发昆明种小鼠宫颈癌建立的可移植性肿瘤模型,接种于615近交系小鼠成功率近100%,现多以昆明小鼠为宿主,肿瘤为实体型,具有血液和淋巴系统双重转移特性,其中淋巴转移率>90%,可用于实验研究;并可发生肺转移,但自发转移率不高;尚可接种于小鼠肾包囊膜下造成肿瘤肾侵袭模型。最佳生长期为7~9d,瘤重2~3.5g。接种用瘤细胞悬液制备及接种体积同前。
3.小鼠乳腺癌EMT6
宿主为BALB/c近交系小鼠,接种部位常为右腋皮下,实体型生长,最佳生长期12~14d,瘤重2~3.5g,接种用瘤细胞悬液制备及接种体积同前。
4.小鼠乳腺癌MA737
宿主为TAⅡ小鼠,实体型生长,接种方式可采用细胞悬液或组织块,最佳生长期14~16d,瘤重2~3.5g。
5.小鼠黑色素瘤B16
小鼠B16黑色素瘤模型于1954年由Jackson研究所C57BL/6J系小鼠耳部皮肤自发黑色素瘤建立,具有黑色素生成能力和一定的转移性。体外培养时细胞可贴壁生长,可接受诱导分化生长为成熟的上皮样细胞,常用于分化诱导剂的体外筛选。宿主C57BL/6小鼠,实体型生长,皮下接种,最佳生长期12~14d,瘤重2.5~4g,其高转移性克隆株可用于人工肺转移模型。
6.小鼠膀胱癌BST739
宿主为T-739近交系小鼠,实体型生长,右腋皮下接种,最佳生长期12~14d,瘤重2.5~3.5g,接种用瘤细胞悬液制备及接种体积同前。
10.3.5白血病
1.小鼠L1210
小鼠白血病L1210是于1948年由甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠所建立,宿主为DBA/2或其杂交一代BDF1(C57BL/6×DBA/2),是最为常用的移植性动物肿瘤模型,国内抗肿瘤药物初筛采用的3种瘤株组合之一。腹水型生长,最佳生长期6~7d,平均存活期8~11d,腹腔接种,接种细胞数为每只1×1000000/ml。
2.小鼠P388
小鼠白血病模型,宿主、肿瘤生长特性及接种方式参照小鼠白血病L1210。
10.3.6艾氏腹水癌
腹水瘤是通过人工建立的一种动物肿瘤模型,腹水提供了肿瘤细胞良好的生长环境和瘤细胞悬液制备的便利,是一种有益的实验性举措,而最具代表性的就是艾氏(Ehrlich)腹水癌。Ehrlich腹水癌是自发于雌性小鼠乳腺的实体瘤,后经人工建立为腹水瘤,不同种系小鼠间可互传,如C57BL/6、BALB/c等,但常用昆明远交系小鼠,也可实体型生长并与腹水型互转。最佳生长期6~7d,平均存活期11~14d,接种细胞数每只(2~4)×1000000/0.2ml。
10.3.7常用小鼠肿瘤转移模型
小鼠肿瘤转移模型可通过特定部位接种而形成,如昆明小鼠 Hep肝癌脾内移植后的肝转移模型、615小鼠宫颈癌U14脾内移植后的肝转移模型等,但应用最广泛同时也是操作最简便的是小鼠肿瘤的肺转移模型,如小鼠肺癌LA-795的自发性肺转移率达100%,但由于其宿主近交系小鼠T-739近年来供应不足而难于普及。下面介绍两个其他小鼠肿瘤肺转移模型。
1.小鼠Lewis肺癌自发性肺转移模型
Lewis肺癌是一株恶性程度较高的自发性肺内未分化上皮样癌,宿主为C57BL/6近交系小鼠,移植于皮下或足趾后,瘤细胞增殖侵袭周围正常组织和血管,通过血行播散在肺部形成转移灶后增殖生长形成肺转移瘤。上述过程基本类似于人类肿瘤从生长到转移所经历的一系列步骤,故称之为癌的自发性肺转移。接种部位常规为腋下,肺转移灶最佳观察期为接种后3~4周,为避免肿瘤生长过大造成动物负担过重导致死亡,接种细胞要低于常规数目,可选择每只(5~8)×100000/0.2ml。也可采用足趾皮下接种,接种量为腋下的1/10,接种后12d左右自膝关节截除荷瘤下肢继续饲养,观察肺转移灶的形成。关于肺转移率的大小,不同文献报道各异,概括为53.8%~97.3%,其瘤源质量,宿主小鼠的体重、周龄甚至不同来源均对其产生影响,据笔者经验约80%左右。
2.小鼠黑色素瘤B16-F10人工肺转移模型
B16是C57BL/6小鼠耳根部皮肤发现的自发性黑色素瘤,20世纪70年代Fidler在该瘤株中筛选出肺部高转移的克隆株,命名为B16-F10。B16-F10对淋巴细胞敏感,小鼠静脉内移植后可形成肺转移瘤而肺外转移极少。将肿瘤细胞直接注入小鼠血液循环中导致肿瘤的肺转移而建立的模型称之为“人工转移”(artificial metastasis)或“实验性转移”(experimental metastasis)模型,用于区别“自发性转移”(spontaneous metastasis)模型。一次性把大量的瘤细胞直接移植入血液循环,实际上是省略了癌转移过程中癌细胞局部侵袭进入血管的过程,而集中体现了癌细胞自进入血液循环后至转移瘤形成的几个步骤。这对于研究肿瘤细胞在循环系统中的生存表现,癌细胞附着、穿越靶器官血管的能力和探讨癌转移的器官特异性则具有独特的优势。取体外培养处于生长对数期的B16-F10细胞,胰酶消化,PBS或生理盐水制备单细胞悬液,浓度5×100000/ml,C57BL/6小鼠每只尾静脉注射细胞悬液0.2ml,3周后处死小鼠,解剖显微镜观察肺部可见黑或黑灰色相互不融合的转移灶,每鼠全肺约50~100个。