斑马鱼：纳米技术介导的神经特异性药物实时输送模型

摘要：向大脑输送药物一直是研究界和医生面临的挑战。血脑屏障（BBB）是将药物输送到大脑和中枢神经系统特定部位的主要障碍。它在生理上由复杂的毛细血管网络组成，以保护大脑免受任何侵入性介质或外来颗粒的侵害。因此，成功的干预治疗必须了解 BBB。最近的研究表明，斑马鱼作为评估BBB通透性的模型已经大量出现，在斑马鱼和哺乳动物之间，BBB的结构和功能高度保守。斑马鱼模型系统具有诸多优点，包括易于饲养、繁殖力强、胚胎和幼虫透明。因此，它有可能发展成为一种模型，用于分析和阐明BBB对具有神经特异性的新型渗透技术的渗透性。纳米技术现在已经成为工业界和研究界向大脑输送药物的一个重点领域。斑马鱼是评估纳米颗粒生物相容性和毒性的优秀模型系统。对于神经特异性药物递送和脑疾病潜在疗法的新技术的发现或开发必不可少。

简介：药物递送是指将化合物转移到体内以达到治疗目的的方法。这些化合物主要是药物性质的，并针对体内特定细胞群的特定疾病条件。药物递送一词包含两个主要概念：剂量形式和给药途径。适当的药物输送通过调节以下因素确保有效的药物活性：药物释放、细胞吸收和系统内的正确分布。一些常见的给药途径包括肠内（胃肠道）、肠胃外（通过注射）、吸入（嗅觉介导）、透皮（通过真皮）、局部（通过皮肤）和口服途径（通过食道）。在治疗学领域，给药至关重要，意义重大。所选择的方法必须是最有效且对系统毒性最小的方法。当涉及的器官是大脑时，问题变得更严重。几十年来，研究人员一直在努力将药物输送到大脑。然而，似乎并不成功。这场斗争中最大的障碍是跨越血脑屏障（BBB）的能力。BBB 是一种生理屏障，可保护我们的大脑免受从血液转移到大脑的化合物的伤害。屏障的自然构成只允许血流中非常小的分子进入大脑。 分子量< 400 Da的小分子和脂溶性分子具有穿透大脑的能力。神经特异性药物必须满足这些参数，才能有效传越血脑屏障。目前，大多数以大脑为靶点的药物都未能成功跨越血脑屏障。由于现有药物靶向大脑的成功率极低，因此迫切需要新型神经特异性药物递送技术。 除了血脑屏障的通透性受限外，还需要注意大脑的复杂性以及现有药物输送技术造成的副作用。缺乏一种绝对有效的神经特异性药物递送方法阻碍了该领域有效药物的开发。研究界已经探索了各种途径，为大脑提供安全和有针对性的药物。纳米技术因其对脑部药物传递研究的蓬勃发展而越来越受到科学界的关注。随着纳米技术的发展，纳米毒理学领域也在同步扩张。 纳米粒子的毒性评估在分析纳米粒子对单个物种和整个环境的影响方面起着关键作用。斑马鱼已被广泛用于实验生物学的研究，目前正在发展成为研究纳米毒性的强大模型系统。就纳米毒性的模型系统而言，斑马鱼有几个优点。作为实验动物使用非常经济，并且易于维护。首先也是最重要的是，斑马鱼的神经系统可能不像人类那样复杂和发达；啮齿动物和小鼠的神经系统相对发达，可用于研究复杂的人脑疾病。其次，斑马鱼缺乏一些人体器官系统，如肺、前列腺和乳腺；此外，斑马鱼基因缺失引起的疾病也无法研究。然而，斑马鱼与人类基因组有70%的相似性，与人类致病基因有84%的同源性，这使得它非常适合模拟人类疾病病理学。以前曾假设成年斑马鱼没有肝脏巨噬细胞。 Kupffer细胞被认为仅在早期胚胎阶段短暂存在，而在发育后期则不存在或稀少。然而，最近的工作表明Kupffer细胞的造血起源及其在成年斑马鱼肝脏中的持久性，使斑马鱼也擅长研究Kupffer细胞。此外，高等脊椎动物模型比斑马鱼更能准确地模拟复杂的人类病理学。本文以斑马鱼为模型系统，讨论了纳米技术介导的药物向大脑传递的最新研究。总结了 BBB 的障碍和各种纳米药物优化、毒性评估以及使用斑马鱼胚胎和成年鱼治疗神经退行性疾病的影响。 最后，该综述强调了用于神经特异性药物递送的斑马鱼模型的优缺点，并揭示了它对未来转化研究的巨大影响。

血脑屏障：神经特异性药物传递的主要障碍

BBB限制物质进入大脑，因此充当有助于维持正常大脑稳态的扩散屏障。 几个细胞参与组成BBB的复合结构。周细胞、星形胶质细胞和神经元构成细胞成分，而内皮细胞、紧密连接和基底膜共同构成 BBB。小分子不会通过大脑内皮细胞表面扩散。 即使是水溶性物质也会因内皮细胞间连接的存在而受阻，如紧密连接、粘附连接和缝隙连接，连接内皮细胞这些内皮细胞依次被周细胞、星形胶质细胞和基底膜包围，构成BBB的结构。粘附连接和紧密连接调节内皮细胞层的通透性。缝隙连接由连接蛋白分子组成，控制内皮细胞之间的通讯。分子可以通过两种途径穿过 BBB：细胞旁途径或跨细胞途径。在细胞旁途径中，离子和分子通过浓度梯度在细胞间被动扩散通过BBB。跨细胞途径利用各种机制，如跨细胞作用或受体介导的运输，使分子通过细胞。几个参数如分子量、表面电荷、表面活性、分子的溶解度和分子的相对大小影响BBB的渗透率。

血脑屏障：现代给药技术

健康大脑中的血脑屏障（BBB）主要起扩散屏障的作用，以保护正常的大脑功能。它阻止了大多数化合物从血液转移到大脑。严格的BBB只允许非常小的分子进入大脑；然而，观察到BBB在疾病条件下被破坏。

为什么纳米粒是神经特异性药物递送的当前选择

美国国家纳米技术研究所将纳米技术定义为至少存在于一个维度中且尺寸范围在1到100纳米之间的任何材料。在过去的十年里，纳米技术及其在生物医学领域的应用蓬勃发展 。纳米技术的应用在靶向给药方面有几个优势包括：（a）将水溶性较低的药物输送到各自的靶点；(b) 两种或多种类型的药物以实现组合治疗，(c) 在特定作用部位靶向输送，（d）穿过紧密屏障（即血脑屏障）的药物输送，（e）更好地理解和分析药物活动的可视化机会和（f）在药物活动模式下实现完美疗效的实时跟踪设备。因此，纳米技术在神经特异性治疗方面具有巨大潜力。

神经特异性药物递送斑马鱼模型：斑马鱼是一种经过验证的脊椎动物模型，用于探索发育研究和退行性疾病研究。斑马鱼胚胎具有外部发育，完全透明，因此可以对其进行广泛的视觉研究。并能用于筛选破坏正常生长，发育和细胞周期的试剂。它们显示了从表观代谢到关键结构最终发育的全面发育模式。斑马鱼被广泛用于神经精神病学研究，以分析纳米颗粒介导的药物递送中的发育毒性。通过简单的光学显微镜观察到，斑马鱼暴露于金纳米颗粒会破坏正常的眼睛发育和色素沉着。给斑马鱼注射金纳米粒子会导致基因毒性效应和基因组结构的严重改变。通过分析二氧化硅纳米颗粒对心血管系统和死亡率的影响，确定其剂量和时间依赖性毒性。与普通壳聚糖相比，壳聚糖纳米粒具有更高的相容性。用于临床干预的纳米颗粒必须是可生物降解和无毒的，这一点至关重要。纳米颗粒在靶向给药和转化研究领域具有巨大潜力。纳米颗粒使用的广泛增加暗示了这些纳米载体对人类过度暴露的潜在危险。纳米颗粒的毒性研究是纳米技术不可或缺的一部分。在将纳米颗粒用于临床之前，必须在细胞和分子水平上对其相互作用进行研究，以分析其毒性。斑马鱼被广泛用作评估纳米颗粒毒性和生物相容性的模型系统，在研究纳米颗粒的神经毒性和高通量筛选方面具有巨大潜力。除了斑马鱼之外，没有其他模型如此适合进行此类分析。 该模型系统可用于研究、分析和管理纳米材料毒性引起的风险。

纳米颗粒介导的斑马鱼胚胎给药研究进展：为了使用纳米颗粒靶向大脑，必须事先了解其在体内的作用。斑马鱼模型最适合这个目的。最近的研究使用纳米颗粒来获得斑马鱼幼虫孵化的重要信息。TiO2纳米颗粒的使用以剂量依赖的方式诱导幼虫早期孵化。Chen等人认为TiO2纳米颗粒对幼虫游泳行为有影响，影响速度和活动水平。另一方面，Ong等人研究发现纳米颗粒暴露后完全抑制了幼虫的孵化和造成胚胎死亡。他们进一步补充说明，胚胎死亡的原因是纳米粒子与胚胎的物理相互作用，而不是纳米粒子物理化学性质的影响。当斑马鱼幼虫暴露于TiO2纳米颗粒时，也观察到甲状腺内分泌系统的破坏。铅的积累被认为是这种不良影响的原因。据报道，TiO2纳米颗粒还可显著激活BDNF、C-fos和C-jun的表达水平。相反，也发现它对p38、NGF和CRE等基因有抑制作用，导致斑马鱼脑损伤。TiO2 纳米颗粒也被证明对鱼的繁殖能力有不利影响，导致排卵数减少 9.5%。Vogt等人报道了在受精后24-48小时加入小分子BCI时斑马鱼胚胎的化学毒性。Ali和Legler等人发现，即使在低剂量下，壬基酚纳米颗粒也会导致胚胎畸形。C60富勒烯衍生物，树状呋喃烯纳米颗粒（DF-1）对斑马鱼胚胎的神经保护作用也已通过评估其毒性进行了报道。将二氧化硅纳米粒子施用于鱼胚胎会导致死亡率增加，而氧化锌纳米颗粒可增加死亡率，并可导致皮肤溃疡，延迟孵化。Brun 等人 首次报道了水性纳米粒子暴露对调节免疫系统基因的影响。这项研究强调了分子反应作为生物毒性指标的重要性。斑马鱼胚胎植入癌细胞并进行聚核糖体纳米颗粒的实时成像，以了解纳米颗粒的毒性和治疗策略。

使用不同发育阶段的斑马鱼胚胎进行的生物成像揭示了胆酸钠包裹的银纳米粒子的毒性作用。这项研究非常重要，因为它提示银纳米颗粒产生的毒性会影响鱼类的鳃和鳃盖发育。这种抑制作用主要是由银离子在鳃中的相互作用引起的，它们阻断了 Na + /K + ATPase 的活性。据报道，铜纳米颗粒对鱼类鳃的生长具有类似的抑制作用。在幼虫中使用铜纳米粒子导致畸形和孵化延迟。应用金纳米粒子对幼虫无毒害作用，而纳米银粒子则影响发育。由锌、镁、铁、铜和镍制成的纳米颗粒对成虫没有毒性，但在幼虫中观察到孵化延迟。有机化合物富勒烯的纳米颗粒也已被证明在浓度低于 200 毫克/升时对幼虫无毒。此外，还表明，与普通的壳聚糖颗粒相比，壳聚糖纳米颗粒更有效且无毒。关键参数是剂量和暴露时间。 更高剂量的 TiO2 NPs 证明对幼虫是致命的，因为 NP 在鳃、心脏、肝脏和大脑中积累。基因毒性效应也是鱼类接触高剂量二氧化钛的结果。长期暴露于较低浓度 (< 4 mg/L) 的 TiO2 NPs 会导致较低的毒性和较高的死亡率。纳米颗粒的另一个重要特征是纳米颗粒的形状及其表面的蛋白质。颗粒柱状六方晶的ZnO纳米粒影响斑马鱼的细胞周期，而与球形 NPs 相比，叶形且涂有聚合物的 ZnO NPs 显示出更高的生物相容性。此外，已经表明纳米棒比球体和立方体纳米颗粒毒性更大。铁纳米颗粒会导致幼虫严重畸形和成虫的遗传毒性作用。

考虑到当今世界塑料造成的日益严重的破坏，Pitt 等人。 显示了它对斑马鱼的影响。 他们观察到，发育中的斑马鱼对水生生态系统中可用的纳米塑料高度敏感。这些纳米颗粒可以穿透绒毛膜，对它们的生理和行为反应产生令人沮丧的影响。研究表明，具有高表面积/体积比的非常小的纳米粒子有能力从环境中吸收污染物。研究了聚苯乙烯纳米塑料珠在化妆品中的应用，以了解其发育毒性和对斑马鱼胚胎的影响。

斑马鱼为神经特异性药物递送提供完整的病理学研究模型：将药物输送到大脑时，可能会发生多种不良反应。斑马鱼模型提供了详细研究不良反应的优势。致畸性：通过观察透明的斑马鱼胚胎，可以轻松评估任何类型的异常致畸生长或发育。在畸胎瘤形成过程中可以观察到的主要干扰包括眼睛的色素沉着、死亡率、心血管系统的变化以及对孵化的影响。免疫毒性：斑马鱼对药物或纳米颗粒产生的免疫反应进行了研究。导致中性粒细胞和巨噬细胞的积累。据报道，使用金纳米颗粒可破坏炎症免疫反应，而另一方面，银纳米颗粒可诱导炎症反应。基因毒性：可以通过实时 PCR 和其他彗星试验观察 DNA 水平上发生的变化。最近对碳基纳米颗粒的研究引起了越来越多的关注，主要是因为它们的低毒性。碳纳米颗粒以各种形式在斑马鱼体内使用，包括富勒烯、碳纳米颗粒、碳纳米管（CNT）、石墨烯量子点和碳量子点。对斑马鱼的研究表明，富勒烯NPs的毒性取决于其表面的电荷。研究表明，水溶性富勒烯具有作为自由基清除剂防止细胞死亡的能力。碳纳米管 (CNT) 具有独特的物理化学特性，因此对研究人员来说是一种有吸引力的药物输送方式。

神经特异性纳米颗粒：斑马鱼到人类的转化途径

使用斑马鱼模型研究各种人类疾病的研究正在增加。使用斑马鱼模型分析和评估了各种最先进的技术。斑马鱼已被证明是详细研究荧光纳米金刚石 (FND) 的合适模型系统。Chang等人利用斑马鱼卵黄细胞进行单粒子追踪，研究了FNDs的光稳定性和无毒性。利用激光共聚焦显微镜和斑马鱼实时荧光标记技术对ND进行了评估，以促进其作为纳米标签的应用。因此，可以探索斑马鱼模型来评估NDs作为纳米标记系统传递神经特异性药物的潜力。斑马鱼与人类的高度遗传和系统相似性验证了斑马鱼的使用。 斑马鱼的再生能力也是其生理学的一个非常有趣的方面，这使其成为研究神经退行性疾病的重要模式生物。使用斑马鱼模型系统可以轻松评估所有上述重点领域。 

结论：血脑屏障是药物进入大脑的主要障碍。血脑屏障的生理功能是保护大脑免受外来物质的侵害。当前需要的是一种能够克服BBB的药物输送策略。只有这样才能有效治疗大脑特定疾病。基于纳米技术的跨 BBB 药物递送方法似乎在未来神经特异性药物递送领域具有广阔的前景。在基于纳米技术的毒性研究和神经特异性药物递送方面，斑马鱼模型是最受欢迎的。需要利用该模型对纳米技术进行进一步研究，从而在神经特异性药物传递的发现方面取得可能的突破。

原文出自：Zebrafish: A Promising Real-Time Model System for Nanotechnology-Mediated Neurospecific Drug Delivery | SpringerLink