摘要：造血干细胞 (HSC) 移植和实体器官移植仍然是许多血液系统恶性肿瘤和终末期器官疾病的唯一治愈选择。不幸的是，长期免疫抑制的后遗症以及急性和慢性排斥反应都会带来严重的疾病，包括感染、恶性肿瘤和移植物丢失。许多小鼠模型已经证明了使用HSC、调节性T细胞、间充质干细胞和调节性树突状细胞的辅助细胞疗法在调节同种异体免疫应答以促进移植物耐受方面的功效；然而，将这种鼠类方法转化为其他临床前模型和临床试验结果喜忧参半。大型动物，包括非人类灵长类动物、猪和犬科动物，提供了一个更严格的免疫学模型来测试这些细胞疗法的临床可转化性。我们强调了大型动物模型对发展和优化造血干细胞和其他细胞疗法以改善器官移植结果的贡献。

关键词：细胞疗法  大动物模型  造血干细胞  移植

简介：急性和慢性排斥以及与长期免疫抑制相关的有害影响是移植后同种异体移植失败的主要原因。使用“调节性”细胞疗法来预防移植物抗宿主病（GVHD）和改善实体器官移植结果是一项长期的努力。尽管许多小鼠研究已经证明了各种“调节”细胞类型在调节同种异体免疫反应以促进移植物耐受方面的作用，但将其转化为临床前和临床模型的结果却喜忧参半。与鼠类模型相比，大型动物提供了更多临床适用性和免疫学模型，用于测试新疗法和细胞疗法的可转化性。最常用的大型动物模型包括犬科动物、猪和非人类灵长类动物 (NHP)，每一种都有其独特的优势。尽管NHP在生理和解剖学上与人类最为相似，但监管负担的增加、所需的培训、对个人防护设备的需求、成本、人畜共患风险和社会敏感性对其使用构成了重大障碍。相比之下，猪和狗模型在实验处理、相对易于繁殖和维护以及社会接受方面提供了更方便的选择。

造血干细胞/骨髓移植诱导耐受：由于其独特的遗传特性，小型猪已成为建立外周血动员（PBM）造血干细胞（HSC）和骨髓移植（BMT）在诱导实体器官异种移植耐受的同时预防GVHD的重要模型。从 1970 年代初开始，有选择地培育小型猪以“修复”主要组织相容性复合体 (MHC)，从而开发出 MHC 定义的猪群，并产生了各种遗传品系。这些独特的猪促进了混合造血细胞嵌合体的研究，最大限度地减少 GVHD 对各种器官的耐受性，包括肾脏、皮肤和复合组织同种异体移植物和心脏。小型猪耐受诱导的初始BMT研究采用致死预备方案——1300 cGy全身照射（TBI），然后是供体BM，最终导致供体造血完全嵌合体。这种策略导致继发于BM衰竭或GVHD的死亡率高得令人无法接受。随着时间的推移，出现了一种更细微的方法，导致混合造血嵌合体和GVHD的临床可接受率。这种转变在很大程度上得益于猪体内有效 T 细胞耗竭剂的开发，允许有针对性地耗竭 T 细胞并显著降低辐射剂量（100 至 200 cGy）。此外，使用细胞因子（包括猪干细胞因子、IL-3 和 GCSF）将干细胞“动员”到外周循环的策略允许收集大量 HSC。与非清髓方法相关的残余宿主免疫将 GVHD 和感染的发生率降至最低。这些发现导致人们将注意力转向毒性较小、非清髓性血液系统恶性肿瘤的准备方案，以及对实体器官移植的供体特异性耐受性的发展。

与猪一样，犬模型一直是同种异体 BMT 的长期临床前大型动物模型。然后使用致死剂量的环磷酰胺，进行供者骨髓输注。由于致死性剂量、GVHD和BM失败，许多犬在移植后无法存活，但有少数存活，长期证据表明外周血、BM和淋巴结中存在混合造血嵌合体。同种异体 BMT 的猪/犬和 NHP 模型之间的主要区别在于在实现持久的混合嵌合体方面相对成功。使用非清髓方法在猪/犬体内始终能诱导持久的混合嵌合体，但类似的非清髓方案未能在NHP中诱导持久的混合嵌合体。因此，NHPs可能有显著更多的抗原暴露，导致更有效的同种异体反应性记忆T细胞库，其可能抵抗T细胞耗竭和化学辐射。实现持久混合嵌合体的种间差异有助于证明记忆 T 细胞屏障的重要性，并通过使用“延迟”BMT 方法和更彻底的 CD8+ T 细胞耗竭促进了克服这一障碍的策略。尽管MHC不匹配的NHP模型尚未实现持久的嵌合体，Kawai等人证明只要移植物在暂时性嵌合体期间进行移植，食蟹猴的暂时性混合嵌合体足以诱导对MHC不匹配的同种异体肾移植的耐受性。使用抗胸腺细胞球蛋白 (ATG)、TBI、TI、CyA、脾切除术和供体骨髓输注方案，4 只动物中有 4 只实现了短暂的三系嵌合，并接受了来自 BMT 供体的同种异体肾移植物，而没有免疫抑制。该模型中保留供体BM、CyA或TBI/TI可防止混合嵌合体的诱导，并消除对移植肾同种异体移植物的耐受性，证明了每种成分的必要性。将抗CD154作为脾切除术的替代物引入该模型显著改善了供体骨髓移植，导致更高的外周嵌合体发生率和更长的时间，并改善了肾移植的结果。此外，这些研究强调了外周共刺激阻断机制在诱导暂时性混合嵌合体后对长期移植物耐受的重要贡献。值得注意的是，在该系统中，只要在暂时性造血嵌合现象消失后 2 至 3 个月内引入移植物，接受来自同一 BM 供体的肾移植物是可行的。NHP 的后续研究使用瞬时混合嵌合体的方法来诱导对其他器官的耐受性，包括“胰岛肾”、肺和心脏。在接受血管化胰岛肾移植的猕猴中，Pathiraja 等人成功地使用抗猴 CD3-IT 代替 ATG 来消耗 T 细胞，作为耐受诱导方案的一部分。与兔 ATG 相比，CD3-IT 在消耗 NHP 中的外周淋巴结 T 细胞同时保留其他免疫细胞方面更有效。将CD3-IT纳入NHP耐受诱导方案可能允许更完全的宿主T细胞耗竭，导致稳健和持久的混合供体嵌合体，并提高供体同种异体移植物存活率。淋巴细胞嵌合现象已被证明是诱导对同种异体移植物耐受的关键组成部分。 Ramakrishnan 等人发现 BMT 后区室化的、较差的 T 细胞嵌合体不足以促进肾同种异体移植物的耐受。这也可以解释联合 BMT/肝移植后 NHP 不能耐受同种异体肝移植，在联合BMT/肝移植中仅实现了低水平的淋巴嵌合体。与其他器官相比，与同种异体肝移植相关的抗原负荷和暂时淋巴细胞增加可能会增加肝脏耐受阈值。今后，应关注诱导多系嵌合体（包括淋巴细胞嵌合体）的药物和方案，以实现一致的同种异体移植物耐受。为了改善NHPs中观察到的瞬时嵌合体，已经使用了在完全 MHC 错配的 NHP 中增强供体嵌合体的策略，包括体外扩增自体调节性T细胞（Treg），这在延长嵌合体方面是令人鼓舞的。在单个动物中得到证明，添加自体 Treg延长了三系嵌合体。事实上，利用这一成熟的Treg方案，首次在CD4和CD8谱系中实现了淋巴嵌合体，并且这两个谱系都表达了CD31+细胞，这是新胸腺移植物的标记。

TREGS

如上所述，使用BMT/HSC实现移植耐受与重大挑战相关，包括与预处理方案相关的发病率和GVHD风险。CD4+CD25+FoxP3+Tregs是一种经过充分研究的具有免疫抑制能力的T细胞亚群，通过利用其调节同种免疫反应（包括对供体抗原的免疫反应）的能力，可能为诱导移植耐受提供更具针对性的方法。在移植环境中，Tregs 对于在临床和实验模型中诱导和维持外周耐受至关重要。临床上，越来越多的证据表明，移植受者体内天然存在的大量CD4+CD25high+Treg预示着良好的同种异体移植结果，在实验性小鼠模型中，Treg能够控制同种异体移植排斥反应并诱导耐受。值得注意的是，当 Treg 产生同种抗原特异性时，它们的功能就会增强，这与临床前和临床研究的设计相关。在机制上，Tregs通过多种机制控制效应T细胞反应，包括产生免疫抑制细胞因子（如IL-10、IL-35、TGF-β）、IL-2的高亲和力结合、下调抗原呈递细胞 (APC) 上的共刺激配体，并通过穿孔素和颗粒酶的表达直接杀死 APC。Tregs在小鼠移植系统中的成功应用为肾和肝移植的几个早期临床试验铺平了道路。展望未来，在大型动物移植系统中生成和使用Treg的能力将允许进行重要的机制研究，这些研究在逻辑上可能不适用于人类，并将有助于促进Treg疗法的临床转化。几个小组已经制定了临床相关的方案，用于NHPs中Treg的扩增。Treg 治疗在大型动物模型中的临床实施受到分离和扩展足够数量的具有适当表型和抑制功能的 Treg 的挑战的限制。Duran Strouck等人在食蟹猴中使用IL-2、抗CD3、供体外周血单个核细胞、人工APC和雷帕霉素的组合体外扩增了多克隆Tregs，为期3至4周。该策略产生足够数量的Treg，以支持约90×106自体Treg/kg的剂量，同时在体外维持Treg抑制功能。同一组报告了其他几种能够在体外扩增食蟹猴 Tregs 以产生足够数量用于体内临床应用的方案。扩增的多克隆Treg被发现是第三方应答者的有效抑制剂，表明其作为“现成”细胞治疗药物的潜力。与 NHP Tregs 类似，猪 Tregs 已在体外产生并表征基因表达和功能特性。尽管尚未在猪中进行过使用纯化或扩增 Treg 过继转移的研究，但一些研究间接证明了 Treg 在猪肾移植模型中对外周维持耐受性的重要作用。犬CD4+调节性T细胞具有与鼠和人Treg相似的表型和特征。在这些已建立的NHP和犬同种异体移植耐受模型中的未来研究可以比较抗原特异性Treg和多克隆Treg的效用，以帮助确定在供体抗原刺激的情况下，体内Treg功能是否得到改善。

间充质干细胞：间充质干细胞（或间质干细胞）是一种多能干细胞样细胞，在实验性小鼠系统中表现出抑制异基因免疫反应（T细胞增殖和促炎细胞因子产生）的功效。MSC免疫调节潜能的重要注意事项是来源和培养基条件，这可以确定它们是否具有预期的抑制特性或非预期的刺激特性。当在适当的条件下培养时，MSCs 在小鼠模型中的免疫调节潜力，再加上易于从 BM 中分离以及通过不同传代保持培养的能力，使 MSCs 成为实体器官移植中有吸引力的辅助疗法。MSC 本身具有低 MHC I 类和 II 类表达，不被认为具有显著的免疫原性潜力，并且对致敏的担忧很小。事实上，有证据表明，一旦注入，MSCs 的寿命很短，大多数被困在肺循环中，只有少数逃逸到外周循环和组织。MSC 的持久免疫调节作用可能通过其他细胞类型（包括 Treg）传递，而不是直接负责抑制体内的同种异体反应。先前已经证明MSCs通过几种不同的机制诱导Treg，包括吲哚胺2,3-双加氧酶和TGF-β。获得基于粘附且 T 细胞污染最小的纯化 MSC 产品的能力从根本上最大限度地降低了体内输注时发生 GVHD 的风险。来自不同NHP的BM来源的MSC已成功用于延长同种异体移植物存活时间。微型猪是复合组织移植研究的流行模型，Kuo 等人成功地从 BM 培养物中生成了猪 MSC，以研究其在异位全层后肢模型中的功效。猪骨髓间充质干细胞在体外被鉴定为表达已知的骨髓间充质干细胞标记物，包括CD44、CD90和CD106，但缺乏CD45、MHC II类和共刺激受体CD80的表达。在体内，猪骨髓间充质干细胞单独使用或作为包括照射、BMT和28天CyA疗程的方案的一部分使用。单独使用时，猪骨髓间充质干细胞与未经治疗（9至14天）相比具有适度的存活益处（15至25天）。当在免疫抑制方案中使用时，益处增加；猪接受MSCs、辐射、BMT和CyA后，循环外周血中CD4+/CD25+调节性样T细胞的频率显著增加。

调节性树突状细胞：树突状细胞（DC）是骨髓源性细胞的异质群体，可进一步细分为亚群，包括浆细胞样DC、常规髓样DC和朗格汉斯细胞等。DC是先天免疫系统和适应性免疫系统之间的关键环节；浆细胞样树突状细胞是应对病毒感染的1型INF的主要来源，而常规树突状细胞是负责摄取、处理和向T细胞呈递外源抗原的专业APC。在小鼠模型中，来自BM的DC子集，称为DCREG，保留耐受性。DCregs通过克隆缺失等中枢机制以及包括treg扩增在内的外周机制促进对外源抗原的耐受。人类体外研究表明，DCREG可以调节记忆T细胞的活性，记忆T细胞是移植耐受的重要障碍。在Ezzelarab等人报告的一项研究中，供体恒河猴CD14+单核细胞是通过外周血动员GM-CSF/G-CSF动员和白细胞分离获得的。DCregs 在 CD14+ 细胞与 IL-4、IL-10、维生素 D3 和 GM-CSF 培养后产生。基于这些有希望的临床前NHP研究，正在进行早期临床试验，以评估首次肾移植受者中自体耐受性树突状细胞和供者来源的树突状细胞在肾和肝移植中的疗效。自身免疫性疾病（1型糖尿病和类风湿性关节炎）的1期研究结果支持DCreg给药在人类中的安全性。

结论：大型动物模型提供了小鼠模型和临床应用之间的重要联系。具体而言，在过去30年中，大型动物极大地促进了对HSC和实体器官移植中细胞治疗的免疫生物学的理解。展望未来，随着用于移植的新试剂和新兴技术（例如，CAR T 细胞）的出现，大型动物将继续在从基础科学到临床实施的桥梁中发挥重要作用。

原文出自：Cellular Immunotherapies in Preclinical Large Animal Models of Transplantation - ScienceDirect