摘要：自1981年首次出现在生物医学研究领域以来，斑马鱼已被用作脊椎动物模型生物，参与了超过40000项生物医学研究。特别有用的是在分子、细胞内细胞器、细胞或组织特定方式中表达荧光蛋白的斑马鱼系，因为它们允许实时和在体内可视化和跟踪感兴趣的分子、细胞内细胞器、细胞或组织。本文我们总结了具有代表性的转基因荧光斑马鱼品系，它们对信号转导、颅面骨骼系统、造血系统、神经系统、泌尿生殖系统、消化系统和细胞内细胞器的生物医学研究产生了革命性的影响。

信号转导：斑马鱼早期胚胎发育受到各种信号级联的严格调控，这些信号级联应在有限的域和时间窗内依次激活。受精胚胎由与转化生长因子β（TGF-β）相关的母体基因的表达决定，包括radar、骨形态发生蛋白2（bmp2）、bmp4和bmp7。早期胚胎发育期间的腹侧组织在母体合子转变阶段开始时被各种BMP拮抗剂导致表达突然中断。这些基因的表达由经典 Wnt (Wnt/β-catenin) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 信号触发，并且仅限于假定的组织区域。这些组织区域的形成是后续前-后（AP）体轴规范的先决条件。AP模式化是一个复杂的过程，由母体 Wnt/β-catenin 信号触发，其活性是诱导Nodal（另一种TGF-β相关信号）所必需的，通过该信号，在组织和胚盘边缘刺激FGF表达。异位表达的淋巴结会导致严重的胚胎背向化，因为它会拮抗BMP信号，而淋巴结的缺失会破坏中胚层的特性，使外胚层不受影响。这些信号通路在后期胚胎发育中也起着关键作用，特别是在左右模式和器官发生中。已经产生了各种转基因斑马鱼品系来研究上述信号通路以及它们低激活或高激活的后果。为了研究BMP信号的作用，Pyati等人在热休克启动子[Tg（hsp70l:dnBmpr-GFP）]的控制下，将显性负BMP受体融合到GFP的基因组中，构建了转基因斑马鱼系。有了这一转基因系，他们能够通过在不同发育阶段将该系暴露于热休克来描述BMP信号在原肠胚中期形成前后的作用。为了观察活胚胎中的BMP信号，在小鼠分化抑制因子-1增强子的BMP反应元件的控制下，已经产生了几个表达各种荧光蛋白的转基因系：Tg（hsp70l:dnBmpr-GFP）、Tg（BmpRE-AAVmlp:EGFP）、Tg（BRE-AAVmlp:d2GFP）和Tg（BRE-AAVmlp:dmKO2）。EGFP 表示增强的 GFP。为了追踪淋巴结活动，Dubrelle等人测量了Smad2的核积累，Smad2是淋巴结信号激活的标志。为了准确量化 Smad2 的核质比，他们生成了一个普遍表达 GFP-Smad2 的转基因斑马鱼系，观察了 GFP-Smad2 在囊胚阶段沿着从植物轴到动物轴的扩散节点梯度的分级核积累。有几个品系可用于研究活胚胎中Wnt/β-catenin信号传导。在Tg（top:GFP）转基因系中，荧光报告基因受TOPFlash控制，TOPFlash包含四个与c-fos最小启动子并列的一致TCF/LEF结合元件。还开发了转基因荧光斑马鱼系，其中 GFP 或核 mCherry 由非洲爪蟾基因 siamois 的最小启动子的增强子区域驱动，具有七个串联重复的 TCF/LEF 结合元件：Tg（7xTCF Xla.Siam:GFP）、Tg（7xTCF Xla.Siam:nlsmCherry）、Tg（kdr:EGFP）、Tg（Tie2:EGFP）、Tg（myl7:EGFP）、Tg（sox10:mRFP）、Tg（hsp70l:dkk1-GFP）、Tg（hsp70:wnt8a-GFP）和Tg（fli1:EGFP）。Moro等人确定了斑马鱼对典型Wnt刺激敏感的组织，包括下丘脑、鳃弓和嗅球和泄殖腔孔。与规范 Wnt 信号相反，据我们所知，转基因斑马鱼系尚未用于研究非规范 Wnt 信号。 因此，在实时和活体内探索由非规范Wnt信号控制的斑马鱼平面细胞极性具有挑战性。由于双特异性磷酸酶 6 的内源性表达在整个斑马鱼发育过程中由 FGF 信号直接控制，Molina等人在分离的dusp6启动子的控制下引入了不稳定的EGFP。由此产生的Tg（dusp6:EGFP）对FGF信号高度敏感，并允许可视化FGF反应性组织。此外，由于 Tg(dusp6:EGFP) 对特定的 FGF 信号化学拮抗剂敏感，因此该报告胚胎对于识别改变 FGF 信号的化合物非常有用。采用 Hsp70 启动子生成 Tg(hsp70l:dnfgfr1-EGFP) 斑马鱼，可被中等热刺激激活。Tsai等人利用肝细胞特异性启动子（肝脂肪酸结合蛋白（lfabp）启动子）在肝脏中特异性表达dn-fgfr1的转基因斑马鱼。成年Tg（fabp10a:dnfgfr1-EGFP）表现为肝脏病理学，如肝脏脂肪变性和胆汁淤积，表明维持肝脏FGF信号是脂质稳态所必需的。

颅面骨骼系统：颅面骨骼的形成是一个复杂的过程，需要通过来自神经嵴 (NC)、内胚层、中胚层和外胚层的细胞介导的一系列发育事件。颅面骨骼主要来源于颅神经嵴（CNC）细胞，这些细胞分布于咽弓。CNC细胞成为称为外间充质的成骨前体，然后是软骨细胞和成骨细胞，随后分别形成面部软骨和骨骼。虽然CNC是颅面部骨骼发育的重要过渡细胞群，但咽内胚层、中胚层和外胚层是CNC形成颅面部骨骼所必需的。在胚胎发生过程中，头部外胚层形成一系列内折，称为裂，咽内胚层形成一系列外折，称为囊。内胚层囊与外胚层裂隙一起分割咽弓，在颅面骨骼发育过程中对 CNC 细胞的存活和分化具有重要的信号传递功能。虽然咽弓的头部中胚层主要是肌源性的，但它也通过建立和形成咽内胚层来促进颅面骨骼的发育。因此，为了更好地理解颅面骨骼的发育，需要跟踪和操纵体内NC、内胚层、中胚层和外胚层细胞的能力。为此，已经产生了几种转基因荧光斑马鱼系，并广泛用于颅面发育的研究。

外胚层间质转基因系：Fli1转录因子标记内皮细胞以及CNC衍生的骨骼形成前体。虽然Tg（fli1:EGFP）转基因细胞系最初是用来观察内皮细胞的，但目前它已被广泛用于观察咽弓内的CNC细胞。Lawson和Weinstein通过筛选P1衍生的人工染色体（PAC）文库，鉴定了含有fli1基因5′端的片段，并将一个15kb的PAC DNA片段亚克隆到pGEM3zf质粒中。EGFP 直接放置在 fli1 起始密码子的上游，产生 Tg(fli1:EGFP) 转基因构建体，用 NotI 将其线性化，然后注射到单细胞阶段的胚胎中以生成 Tg(fli1:EGFP) 斑马鱼。这种转基因斑马鱼标记内皮细胞和 CNC 细胞。 在颅面骨骼发育过程中，该品系在迁移后的咽弓CNC细胞中表达 EGFP。为了了解颅面骨骼形成的早期阶段，该品系以及包括 CNC 在内的 NC 中表达 EGFP 的 Tg(sox10:EGFP) 品系已被用于可视化骨骼前体。

软骨和骨转基因品系：除了标记 CNC 和成骨前体的转基因报告基因外，还开发了许多转基因品系来对体内分化骨架内的不同细胞类型进行成像。包括成骨细胞的Tg（sp7:EGFP）、Tg（RUNX2:EGFP）和Tg（骨钙素：EGFP）以及软骨细胞的Tg（col2a1a:EGFP）和Tg（sox9a:EGFP）。Sp7（Osterix）和RUNX2在成骨细胞祖细胞中表达，而骨钙素（骨γ-羧谷氨酸蛋白[Bglap]）在晚期成骨细胞中表达。Sp7 是一种在成骨细胞而非软骨细胞中表达的转录因子，使其成为成骨细胞的极好标志物。尽管 medaka sp7 基因的 4.1-kb 上游调控区被用于驱动斑马鱼中的 mCherry 或核 GFP 表达，但该转基因系并未完全重现内源性斑马鱼sp7的表达模式。为了克服这种差异，Kimmel 小组希望使用斑马鱼 sp7 的调控区域生成转基因 sp7 报告基因。由于斑马鱼 sp7 表达所需的调控元件未知，他们使用细菌人工染色体 (BAC) 介导的转基因在 sp7 上游序列的控制下驱动 EGFP 表达。使用大肠杆菌重组机制，将包含 EGFP 和卡那霉素抗性盒的 DNA 片段插入到包含完整 sp7 序列的 BAC 中 sp7 编码序列的起始密码子中。所得 BAC Tg(sp7:EGFP) 构建体用于通过 BAC 转基因技术生成转基因品系。在该转基因品系中，EGFP 表达再现了耳原基和骨骼结构（包括成骨细胞）中的内源性 sp7 表达。在成年转基因鱼中，在尾鳍骨射线和截肢后再生鳍射线等骨骼元素中检测到 EGFP。Tg(sp7:EGFP) 系的体内成像显示，sp7:EGFP− 细胞群是颌骨再生中修复软骨细胞的关键来源。该品系有助于在未受伤和再生鳍的 sp7:EGFP+ 成骨细胞中生成表观基因组图谱，包括 DNA 甲基化和染色质可及性。Tg（RUNX2:EGFP）是另一种转基因系，已广泛用于成骨细胞的体内成像。转录因子 Runx2 和 Sp7 对斑马鱼和哺乳动物的成骨细胞分化至关重要，使其成为成骨细胞的极好标志物。Weidinger小组最初产生Tg（RUNX2:EGFP）来研究成年斑马鱼鳍再生的细胞基础。骨钙素是晚期成骨细胞标志物。 为了生成骨钙素报告基因，Weidinger 小组首先克隆了青鳉骨钙素的 3.7-kb 启动子序列，并将其插入 pBluescript 载体中的 EGFP 上游区域，该载体含有 I-SceI 大范围核酸酶位点，位于插入片段的两侧。利用I-SceI介导的转基因技术，将得到的构建物用于创建骨钙素报告基因系Tg。

咽内胚层转基因系：缺乏内胚层或咽内胚层衍生的咽囊导致斑马鱼颅面骨骼的严重缺陷，表明这些组织对颅面骨骼发育至关重要。为了更好地了解咽部内胚层和囊袋如何调节颅面骨骼发育，需要转基因报告细胞系在颅面发育过程中观察这些组织。第一个阐明咽部内胚层形成的转基因报告者是Tg（her5PAC:EGFP）转基因系。Tallafuss 和 Bally-Cuif 分离了一个包含 her5 完整调控元件集的 PAC，这是第一个报道的在 MH 结构域中表达的基因，并通过 ET 介导的同源重组将 EGFP 插入到 her5 基因组区域的外显子 2 中。所得构建体用于通过 PAC 介导的转基因建立 Tg(her5PAC:EGFP) 系。

造血系统：与哺乳动物一样，斑马鱼的造血始于连续的原始和确定性血细胞波。首先，造血的原始波通过来自胚胎中胚层的单能前体产生红细胞和巨噬细胞。能够产生所有成熟血细胞类型的定形造血干细胞 (HSC) 来自造血内皮。已经引入了标记每一种血系的转基因报告系，允许在活斑马鱼中进行实时成像，并通过荧光激活细胞分选 (FACS) 纯化感兴趣的血细胞。

红系转基因系：在早期胚胎发生过程中，红细胞 (RBC) 来自中间细胞团 (ICM)，后者源自后外侧中胚层 (PLM)。为了标记红细胞，Lin组通过将包含斑马鱼GATA-1启动子和GFP（GM2）的线性化构建物G1-GM2注射到胚胎中来生成Tg（gata1a:GFP）斑马鱼。GATA-1 启动子构建体是来自 GATA-1 基因组片段的 5.6-kb DNA 片段，包含 GATA-1 TSS 的 5' 上游区域。该品系已被用于研究胚胎红细胞生成、血小板发育、造血移植、白血病和实时心脏泵血动力学。

髓系转基因系：包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的髓样细胞群起源于前外侧中胚层。为了揭示体内调节中性粒细胞介导的炎症的分子和细胞机制，Huttenlocher 小组分离了一个包含斑马鱼 zMPO 启动子序列的 PAC，并将 zMPO 5'-非翻译区 (UTR) 的一个 8-kb 片段亚克隆到 5' 区域 GFP (zMPO:GFP)，产生转基因系 Tg(mpx:GFP)，其中中性粒细胞在髓过氧化物酶启动子的控制下表达 GFP。Lieschke小组开发了一种巨噬细胞特异性报告品系，用于实时和体内跟踪巨噬细胞及其与中性粒细胞的相互作用。

HSC 转基因品系：其中 HSC 产生不同类型的血细胞。 HSC 可以在个体的一生中自我更新并分化为所有成熟的血细胞类型。为了标记HSC群体，Zon小组产生了三个有价值的HSC特异性转基因报告系。首先，Tg（-6.0itga2b:EGFP）系最初是用来评估斑马鱼的血栓细胞和血栓前体细胞，但结果证明对HSC更具特异性。淋巴转基因系：淋巴细胞生成仅起源于明确的 HSC 祖细胞。rag1和rag2是斑马鱼早期发育过程中淋巴细胞群体的传统标记物，在斑马鱼淋巴细胞成熟的胸腺和成年肾脏中表达。Lin 小组使用这些 rag1 和 rag2 驱动程序生成了淋巴谱系特异性转基因报告系。首先，Tg(rag1:GFP) 是使用包含斑马鱼 rag1 TSS 5´ 4.7-kb 片段的报告基因构建体生成的。Chi诱导的同源重组将GFP基因插入含有rag1启动子的PAC中。

泌尿生殖系统：斑马鱼和哺乳动物之间的肾单位片段模式和细胞组成是保守的。斑马鱼胚胎2 dpf发育出功能性前肾， 4 dpf发育出功能完整的成熟前肾。已经建立了许多标记前肾结构的品系，允许精确确定肾脏中特定细胞的位置、功能和表达谱，并提供非凡的工具来模拟和可视化肾脏发育和疾病的生物学过程。虽然鱼类在其整个生命周期中都会产生肾单位，并在受伤后重新生成肾单位，但哺乳动物只能部分修复其肾单位，不能形成新的肾单位。

肾转基因系：Wilms 的肿瘤抑制基因 wt1 对肾脏发育至关重要，并且在脊椎动物中高度保守。 然而，大多数鱼类拥有两个 wt1 旁系同源基因，wt1a 和 wt1b，而哺乳动物只有一个 wt1 基因。人类 WT1 突变会导致儿童肾癌，以及泌尿生殖道的发育异常。 已经生成了与 wt1 基因表达谱相呼应的转基因品系，以检查斑马鱼胚胎肾、前肾的结构和发育，以及 wt1 基因在前肾发育中的作用。Tg(wt1b:eGFP) 系是通过将 I-SceI 大范围核酸酶和 Tg(wt1b:eGFP) 质粒共同注射到单细胞阶段斑马鱼胚胎中而产生的。Tg(wt1b:eGFP) 斑马鱼幼虫的荧光成像显示每个肾单位的节段组织，它们在 2 dpf 融合到泄殖腔。Tg(wt1b:eGFP) 系对肾脏发育和再生的研究以及针对肾毒性和遗传性肾病（包括遗传性肾小球病和囊性肾病）的药物筛选做出了贡献。为了开发一种在发育过程中增加Lhx1a表达的药物的定量高含量筛选方法，通过I-SceI巨核酸酶介导的转基因产生Tg（Lhx1a:EGFP）系。

消化系统：斑马鱼的消化系统可分为包括食道、肠球、中肠、后肠和肛门在内的胃肠道，以及肝脏和胰腺等附属器官。 为了研究斑马鱼消化系统的发育过程，转基因荧光斑马鱼线已被广泛使用。 在这里，我们总结了标记胃肠道、肝脏和胰腺中各种细胞类型的代表性斑马鱼转基因报告系。胃肠道：斑马鱼的肠道结构与哺乳动物的相似。 为了了解肠腔和肠神经系统 (ENS) 发育的分子机制，已经产生了各种转基因荧光斑马鱼品系。为了建立靶基因的肠道特异性表达， Jen-Leih Wu 小组构建了一个质粒，该质粒含有与 RFP 融合的斑马鱼肠道脂肪酸结合蛋白 (I-FABP) 的 4.5 kb 肠道特异性启动子。将该质粒线性化并显微注射到斑马鱼胚胎中以生成 Tg(fabp2:RFP) 系，该系标记了斑马鱼的肠球和中肠。这种携带 4.5-kb 启动子的 Tg(fabp2:RFP) 系已被广泛用于研究斑马鱼肠道的功能组织和人类胃肠道疾病，如炎症性肠病和小肠结肠炎。肝脏：斑马鱼和哺乳动物肝脏中的细胞类型和代谢途径具有可比性。斑马鱼已成为研究肝脏发育和疾病的重要动物模型。已经开发了在肝细胞、肝内胆管细胞和肝星状细胞中表达荧光蛋白的转基因品系。为了用 EGFP 标记斑马鱼肝细胞， Wu 小组将肝 FABP (L-FABP) 的启动子区域克隆到 pEGFP-C1 中。 所得构建体 pLF2.8-EGFP 用于生成 Tg(-2.8fabp10a:EGFP)品系。超过 50 项研究利用该品系来调查肝脏发育。 例如，该品系被用于确定细胞信号通路在肝脏发育以及药物诱导的肝损伤或基因诱导的肝病中的作用。Didier Stainier 小组建立了 Tg(fabp10a:DsRed) 系来研究肝胰腺导管系统的模式和分化。

胰腺：胰腺由内分泌系统和外分泌系统组成。 为了研究外分泌细胞的分化、增殖和形态发生，Gong 小组使用 elastaseA (elaA) 调控序列 (- 1.8 kb) 进行外分泌特异性表达 GFP。将 Tg(ElaA:EGFP) 质粒线性化并显微注射到单细胞期胚胎中以生成 Tg(ela3l:EGFP) 系。胰腺内分泌系统胰岛由分别分泌胰高血糖素、胰岛素和生长抑素的α-、β-和δ-细胞组成。Argenton 小组使用胰高血糖素 a (gcga) 启动子区域生成 Tg(gcga:GFP) 系，该品系在产生胰高血糖素的胰腺 α 细胞中表达 GFP。可以通过 Tg(mnx1:GFP) 或 Tg(ins:RFP) 品系观察产生胰岛素的胰腺 β 细胞。 

细胞内细胞器：斑马鱼是研究胚胎发生和人类疾病的绝佳动物模型，因为它允许对细胞器和过程进行可视化和操作。生物体的发育受增殖、凋亡、迁移、分化和形态特化的时空调控。蛋白质在内质网合成，在高尔基复合体糖基化，并运输到细胞内或细胞外的靶点。分泌蛋白在每一步通过包含不同蛋白复合物的分泌途径来募集 Rab GTPases 和 SNARE 蛋白，以将囊泡连接到靶向细胞器并促进膜融合。从细胞内细胞器的角度理解这一途径是研究生物体细胞行为和生物学的基础。高尔基体转基因系：为了实时和活体成像发育胚胎中的反式高尔基体分泌途径，Gerhart小组利用Gateway技术从人B4GALT1克隆了氨基酸1-6，并将其与GFP融合到斑马鱼半普遍存在的β-肌动蛋白启动子下游区域，从而产生Tg（β-act:GalT GFP）。利用这种结构和Tol2介导的转基因，他们产生了Tg（actb2:Hsa.B4GALT1-GFP）系，该系已被用于研究在个体发育和再生过程中影响细胞增殖的动态蛋白质分泌途径。

结论：本综述总结了在生物医学研究中广泛使用的转基因荧光斑马鱼品系。随着对启动子和增强子的深入了解，CRISPR/Cas9 介导的敲入技术使转化融合比以往任何时候都更容易。超分辨率显微镜使转基因荧光斑马鱼实时成像和跟踪每个蛋白质成为可能。将转基因荧光斑马鱼品系与荧光蛋白表达的化学或物理诱导相结合，可以实现荧光蛋白表达的时空调控，这可能成为生物医学研究中的宝贵工具。

原文出自：Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research | SpringerLink