摘要：利什曼原虫是每年导致 20,000 多人死亡的病原体。在体外筛选 180 万种化合物确定了 2-氨基苯并咪唑系列对利什曼原虫的有效活性。斑马鱼胚胎模型的使用可以提高这一比率，为哺乳动物节省开发新药的时间和成本。 通过优化程序合成了几种类似物并进行了体外测试，从而得到了一种有前途的2-氨基苯并咪唑衍生化合物（2amnbzl-d），该化合物已用于小鼠体内研究。然而，意想不到的毒性作用阻止了它进入药物开发临床前和临床阶段。 由于细胞模型在检测整个生物体复杂相互作用方面的局限性，为了验证这一假设，我们使用基于急性毒性、肝毒性、神经毒性和心脏毒性测定的胚胎斑马鱼平台，将 2amnbzl-d 与两种已确定安全性的化合物进行了比较：卡马西平和苯硝唑。测试是双盲进行的，结果表明存在致死和致畸作用，浓度高于 7.5 µM 时具有肝毒性，暴露于 15 µM 2amnbzl-d 的胚胎出现神经毒性。然而，苯硝唑暴露没有毒性， 100µM卡马西平暴露引起心动过缓。使用Pltf-AcHpNrCd与斑马鱼复制了在哺乳动物毒理学试验中发现的结果，从而减少了部分试验成本和时间。

背景：细胞培养的体外研究不能很好地预测药物在整个生物体内的吸收、分布、代谢和排泄（ADME），另一方面，体内研究有助于了解新药可能的毒性特性，但它们耗时、昂贵且使用的一定数量的动物。斑马鱼胚胎和仔鱼的寿命长达120小时，被认为是前所未有的毒理学模型，它展示了多种多样的生物过程，并拥有完整的脊椎动物器官系统。斑马鱼可以以快速且具有成本效益的方式弥合体外安全性测定和哺乳动物模型之间的差距。由于ARH受体、CYP酶或ADH同功酶等药物代谢所必需的酶和途径具有高度的遗传保守性，因此它也是研究化合物诱导的肝损伤的优秀模式生物，这些酶和途径在发育的早期就存在并发挥作用。同样，人类和斑马鱼的心血管生理在解剖、细胞和膜生物学水平上也高度保守，因此许多人类心血管药物已被证明对斑马鱼仔鱼的生理学具有相同的作用，许多人类心血管疾病已经在斑马鱼的遗传模型中重现。神经活动可通过胚胎神经行为生物标记物进行评估，该标记物与中枢神经系统的神经肌肉功能相关，可指示神经发育的可能变化，如突触形成和胶质细胞生长。因此，在早期发育阶段的胚胎和幼虫斑马鱼试验中，可能已经预测了药物在临床阶段停用和上市后退出的三个主要原因。利什曼病是一种潜在的致命性被忽视的疾病，影响着全世界数百万人，目前的治疗选择受到治疗时间或毒副作用的限制。从通过体外表型筛选鉴定出的一种很有希望的2-氨基苯达唑开始，合成了数百种类似物，目的是找到一种能够杀死寄生虫并对人体安全的化合物。在健康小鼠中进行了两个有希望的先导化合物为期 5 天的耐受性研究。 25 mg/kg/d的剂量耐受性良好，但50 mg/kg/d或以上剂量治疗的动物表现出临床毒性迹象。在利什曼原虫感染小鼠的后续研究中，结果表明，这两种化合物均无效，2amnbzl-d先导化合物的安全性较差。本研究的目的是评估Ferreira等人发布的新化学实体2amnbzl-d进行体内研究期间确定的毒性是否可以通过使用斑马鱼模型的试验进行预测，从而减少测试的时间和成本。

结果：使用OECD指南236对化合物进行的急性毒性试验表明，暴露于浓度超过25µM的2amnbzl-d的胚胎的致死率与DMSO对照组显著不同。各浓度的累积死亡率见图1。96小时的LC50%为14.8µM。对照组没有死亡，并且在测试期间没有可能影响结果的事件。 将胚胎暴露于卡马西平和苯并咪唑化合物进行的测试在任何测试浓度下均未表现出急性毒性。

图1、与DMSO对照组相比，暴露于各自浓度的卡马西平（a）、苯并咪唑（b）和2-氨基苯并咪唑衍生物（c）的96 hpf的胚胎和健康胚胎的存活百分比图。

图2、剂量-反应曲线显示了使用每种浓度（6.25,12.5,25,50,100µM）的2-氨基苯并咪唑衍生物处理96小时后死亡或畸形胚胎的百分比。

图 1 中可以看到由畸形或死亡曲线表示的致畸作用。 在 6.25 和 12.5 µM 的浓度下，胚胎在评估的 96 小时内仍然存活，但大多数暴露于 12.5 µM 的胚胎没有孵化，呈现蛋黄 囊出血和心动过缓，EC50% 8.57 µM。 另一方面，卡马西平和苯硝唑在任何测试浓度下均未证明对斑马鱼胚胎发育有致畸作用。为了评估心脏毒性、肝毒性和神经毒性，测试的化合物的最大浓度以先前在 OECD 236 测试中获得的 LC50% 作为参考。心率数据未显示对照组 1% DMSO 和 2amnbzl-d 组或苯硝唑组之间的差异。 暴露于 100 µM 卡马西平的斑马鱼仔鱼表现出心动过缓。

图3、心电图示例

 图4、散点图显示了心率相对变化的平均值和分布。

关于肝毒性效应，在所有测试浓度下，暴露于化合物卡马西平和苯硝唑的幼虫组中未观察到肝功能的变化。另一方面，在暴露于高于 7.5 µM 的 2amnbzl-d 浓度仔鱼组中证实了红色肝脏颜色的存在和其大小的增加和/或卵黄囊的保留，表明肝脏功能的变化。

图5、斑马鱼仔鱼120 hpf油红O染色。

图6、 120 hpf 斑马鱼仔鱼暴露于卡马西平 (a)、苯硝唑 (b) 和衍生的 2-氨基苯并咪唑衍生物（c）的肝毒性百分比。

在暴露于15µM 2MnBZL-d的胚胎组中观察到神经毒性效应。与1%DMSO对照组相比，暴露于卡马西平和苯硝唑的胚胎自发运动没有差异，表明没有神经毒性作用。

讨论：斑马鱼胚胎在不到一周的时间内发育出哺乳动物的大部分主要器官系统，包括心血管系统、神经系统和消化系统，并且大多数安全性和有效性分析可以通过斑马鱼胚胎和幼虫进行，并获得与生物学相关的数据。毒理学筛选选择的试验使用了120 hpf以下的斑马鱼胚胎和幼虫，按照国际指令分类为体外模型。2amnbzl-d 化合物在小鼠毒性试验中显示出重要的毒理学发现，其药物研发活动因毒性等原因而停止。为了将获得的结果与仍处于早期药物发现阶段的新化学实体进行比较，使用了世界卫生组织药物清单上的两种核准药物，苯硝唑和卡马西平，因为它们的毒理学特征众所周知。卡马西平是局灶性癫痫、神经性疼痛、精神分裂症和双相情感障碍的常用处方药，常见副作用包括恶心和嗜睡，严重的副作用可能包括皮疹、骨髓功能下降、自杀念头或意识模糊。 有肾脏或肝脏问题及怀孕期间的孕妇应慎用。暴露于大剂量卡马西平的患者中出现心动过缓。苯硝唑是一种用于治疗恰加斯病的特效药，常见的副作用包括皮疹、麻木、发烧、肌肉疼痛、食欲不振和睡眠障碍。怀孕期间或患有严重肝脏或肾脏疾病的人不建议使用。

进行了早期体外安全性评估，其中 2amnbzl-d 显示对 hERG 通道（IC50 > 30 μM）和主要细胞色素 P450 家族酶（IC50 > 20 μM）的低抑制作用，类似地，针对20个标记（涵盖关键人类酶、激酶和受体）中的非靶点小组进行的筛选也显示出对活性的低干扰（EC50 > 10 µM）。另一方面，2amnbzl-d 化合物在浓度高于 7.5 µM 时显示出显著的肝毒性作用，浓度为 15 µM 时在斑马鱼中显示出神经毒性作用。斑马鱼是脊椎动物，因此与包括人类在内的哺乳动物具有高度的序列和功能同源性（超过 70%）。 由于所有脊椎动物的细胞生物学、发育和代谢过程都是保守的，因此对鱼类的研究可以深入了解人类疾病过程，迄今为止所研究的所有蛋白质在鱼类和哺乳动物中都具有相似的功能。因此，在斑马鱼和啮齿动物中证明的2amnbzl-d毒理学效应表明，最初的体外试验不能很好地预测化合物的毒性。关于心脏毒性作用，2amnbzl-d 对 96 hpf 仔鱼的心跳没有影响，但浓度为 100 µM 的卡马西平引起心动过缓。 尽管是监管机构批准的药物，但卡马西平禁用于有心脏问题的患者，并可能导致一些心脏不良反应，如心脏病、心律失常、房室传导阻滞伴晕厥、心动过缓、充血性心力衰竭、冠心病恶化。

结论：由于毒性试验中发现了显著变化，2amnbzl-d在浓度高于4µM时可能会引起与死亡或畸形、肝毒性和神经毒性相关的急性毒性作用。目前的研究表明，2amnbzl-d化合物的毒性可以通过斑马鱼模型在短短5天的评估中预测，并在随后的试验中改进哺乳动物的使用。

原文出自：Zebrafish toxicological screening could aid Leishmaniosis drug discovery | SpringerLink