摘要：从人类多能干细胞（hPSCs）中构建肾脏类器官代表了类器官领域的相关科学成就。重要的是，hPSC衍生的肾类器官包含多个肾单位样结构，这些结构表现出一些肾功能特征，并且能够对肾毒性药物做出反应。我们首先讨论了生物工程方法如何帮助克服目前肾脏类器官的挑战。接下来，我们将重点介绍利用肾脏类器官进行药物筛选和疾病建模应用的最新工作。最后，我们提供了当前研究的最新技术，这些研究旨在探讨源自 hPSC 的肾脏类器官和肾脏细胞在未来肾脏替代疗法中的潜在应用。

关键词：人类多能干细胞  肾脏类器官  疾病建模 CRISPR/Cas9 基因编辑  肾再生  生物工程

简介：在过去十年中，人类多能干细胞 (hPSC) 分化方法在生成三维 (3D) 组织样结构（即所谓的类器官）方面取得了惊人的进展。它们在形态、细胞组成和功能上与体内发育器官部分相似。如今，hPSC已经为许多组织和器官构建的类器官，包括脑、视网膜、肠、肺、胃和肾等。最近，几项工作证明了 hPSC 构建的类器官在疾病建模、药物毒性测试和药物发现应用方面的潜力。生物工程师和干细胞生物学家之间的联盟正在开发强大的方法来控制和外部指导 hPSC 类器官的分化和功能。我们将重点关注 hPSC 构建的肾脏类器官（hPSC 肾脏类器官）的最新进展，重点介绍生物工程方法如何增强肾脏类器官的分化、血管化和复杂性（在细胞组成和功能方面）。此外，我们将讨论hPSC类肾组织在研究人类肾脏发育方面的直接潜力，以及作为体外模型用于药物筛选和疾病建模的价值。最后，我们将特别关注目前研究hPSC衍生肾单位祖细胞（hPSC NPCs）和肾类器官治疗潜力的工作，同时强调现有的挑战和局限性。

构建肾脏类器官：挑战和生物工程解决方案

目前用于构建hPSC类肾脏器官的方案利用了hPSC在特定3D培养条件和肾脏诱导信号前的自组织能力。hPSCs的自组织在很大程度上不仅取决于自身机制决定的形态学和物理性质，而且还取决于细胞外基质（ECM）提供的外源信号。ECM 提供物理支持和生化线索，这是肾脏发育和体内平衡的决定因素。几十年来，大量研究揭示了 ECM 重塑的重要性及其在调节肾脏发育过程中发育信号转导中的作用。事实上，ECM 成分和整合素受体的基因改变是导致多种综合征的原因。同样，异常ECM沉积也会导致慢性肾病和多囊肾病的进展。这一知识可能有助于设计新型仿生材料，用于指导体外hPSC肾类器官生成过程中的肾发生。目前，对肾脏类器官形成和分化过程中发生的细胞自组织过程的外部控制水平仍然非常不精确。这可能在一定程度上导致在当前方法中观察到的肾脏类器官表型的高度可变性（即使是从相同的初始细胞来源产生的）。一种能够有力地指导肾脏类器官的形成和分化可能的外部提供组织特异性指示线索的方法，可能是使用仿生材料作为细胞培养基质，其可设计为含有特定浓度的生长因子和细胞粘附配体，控制孔隙率，粘弹性。最近在肠道、内胚层、肝脏和神经类器官等方面研究了天然和合成衍生基质对类器官生成的影响。工程水凝胶材料也可用于制造微孔系统或组织相关形态。这些基于生物材料的工程方法为改善肾脏类器官分化、再现性和可扩展性提供了巨大的希望，这些特性是疾病建模和药物筛选研究所特别需要的。

图1、hPSC类肾脏生物工程解决方案

最近，已做出巨大努力以提供 hPSC 肾脏类器官的准确分子、细胞和功能特征。在这方面，单细胞组学的最新进展提供了定量方法，将类器官的细胞组成与天然器官（包括胚胎发育、成年或疾病）的细胞组成联系起来。Freedman 实验室的开创性工作在 hPSC 肾脏类器官中进行了单细胞 RNA 测序 (sc-RNAseq)，揭示了细胞簇的存在，这些细胞簇具有近曲小管、足细胞、“早期小管”、“早期足细胞”、内皮细胞和 基质细胞。同时存在表达神经细胞、肌肉细胞、生殖/内分泌细胞、上皮细胞、未分化细胞和增殖细胞标记基因的非靶细胞群。在另一项研究中，hPSC 肾脏类器官的 sc-RNAseq 允许鉴定与发育中的人类肾脏共享的细胞谱系基因表达特征。有趣的是，作者可以确定与早期发育足细胞阶段相对应的肾小球疾病相关基因表达特征。Wu等人在使用两种公认的程序生成的hPSC肾脏类器官中进行了比较sc RNAseq。使用胎儿和成人肾脏样本进行的分析表明，虽然这两种方法都导致细胞成分复杂的肾脏类器官的产生，但它们也产生了约占总细胞20%的非靶细胞（具有神经元和肌肉特性）。此外，这项工作进一步证实了类器官中存在的肾细胞类型的不成熟性。在 Phipson 等人的另一项工作中。通过 sc-RNAseq 报告独立实验中产生的类器官之间的批次差异评估肾脏类器官与类器官的变异性。最近，Subramanian等人比较了使用两种不同方案从四种不同的人类诱导多能干细胞（hiPSC）系产生的肾脏类器官。

迄今为止，hPSC 肾脏类器官的转录分析以及肾脏标志物的免疫荧光经常用于验证具有肾单位样结构的肾脏类器官的分化。此外，hPSC肾脏类器官被证明是足细胞和肾小管药物诱导毒性筛选的体外模型，在肾小管和肾小球结构中显示出特异性损伤反应。在这方面，用于评估肾脏类器官的肾脏功能的自动化高通量测量将促进药物筛选和疾病建模应用。例如，特定肾溶质转运蛋白或损伤生物标志物的报告细胞系可用于通过实时成像分析实时监测类器官反应。同样，用于监测分泌的可溶性生物标志物（如代谢物或分泌蛋白）的微型生物传感器可以集成到微工程平台中对类器官进行原位监测。肾脏类器官的另一个主要限制是缺乏血管化，这会阻碍组织生长和肾脏血液过滤功能。 最近，不同的实验室通过体内移植方法来促进类器官血管化。当皮下移植到免疫缺陷小鼠中时，与体外培养的类器官相比，肾脏类器官显示出具有宿主血管细胞成分的肾小球样结构，血管内皮生长因子 A 和胶原蛋白 IV 的表达增强。在另一项将肾脏类器官移植到免疫缺陷小鼠肾包膜下的研究中，可以证明植入类器官的肾小球内可灌注的宿主毛细血管样结构向内生长。我们的实验室采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）作为血管化hPSC类肾器官的新方法。与体外培养的类器官相比，植入CAM的肾脏类器官显示出增强的肾小球分化特征，并检测到与足细胞样细胞密切接触的人类内皮样细胞，表明这种体内方法促进了肾类器官内内源性人内皮样细胞的组织。总之，这些观察结果表明，体内生理条件（如液体流动）可能会影响肾脏类器官内代表性不足的细胞类型（如内皮细胞）的组织，从而有助于改善肾脏类器官的血管化。在这方面，微流控装置已被证明能够模拟相关流体流动条件，并促进自组织可灌注血管网络的形成。

用肾脏类器官模拟肾脏疾病：迄今为止，肾脏类器官已经开始显示其作为模型系统的效用，通过两种不同的方法来研究肾脏疾病相关表型：i) 利用携带导致肾脏疾病突变的患者特异性 iPSC； ii) 在 hPSC 中利用高效的基因组编辑工具，如 CRISPR/Cas9 系统来操纵和/或引入与肾脏疾病相关的突变。

图2、来源于hPSCs的肾脏类器官的应用。（a） 肾脏疾病模型。（b） 肾脏再生策略。

Bonventre实验室报道了一项利用CRISPR/Cas9基因组编辑在类肾器官中模拟肾脏疾病的开创性研究。作者为常染色体显性遗传多囊肾病（ADPKD）建立了肾脏类器官模型，该模型再现了肾小管囊肿的形成，这是该肾病的一个特征。在另一项研究中，同一实验室使用新开发的高通量筛选平台发现了肌球蛋白在 PKD 进展早期阶段的可能作用。最近的一项研究探讨了从ADPKD患者来源和基因编辑的杂合子和纯合子PKD1突变体HIPSC中提取肾类器官时遇到的不同肾囊肿表型，显示了突变体肾类器官中的肾囊肿如何对抑制ADPKD中囊肿形成的已知化合物作出反应。重要的是，最近用hPSC类肾器官模拟的其他肾脏疾病包括先天性疾病，如肾结核、先天性肾病综合征、常染色体隐性多囊肾病、粘蛋白1肾病、胱氨酸病和肾小球疾病。总的来说，所有这些发现都强调了肾脏类器官在测试潜在治疗化合物的安全性和有效性以及药物发现应用方面的适用性。上述研究的重点是重现原发性肾脏疾病表型。 现在预计肾脏类器官可能很快就会被用来模拟导致流行疾病的肾脏疾病。其他研究已经证明，hPSC衍生类器官在静态培养条件下，包括hPSC衍生血管和心脏类器官，可用于探索糖尿病等系统性疾病，从而扩大类器官在这些组织中探索糖尿病系统性疾病早期特征的用途。有趣的是，通过应用生物打印方法，包括液体流动在内的三维血管化近端肾小管模型忠实地重建了肾脏再吸收功能，并用于模拟高血糖诱导的肾损伤。基于这些初步方法，预计微流体装置的使用将更好地概括体内肾脏的关键疾病相关病理反应。

应用肾类器官研究严重急性呼吸综合征冠状病毒2型感染：迄今为止，不同的研究表明ACE2在多个肺外组织中表达，包括心脏、肾脏、血管和肠道，总体上显示了ACE2在人体内的广泛分布。事实上，与SARS-CoV-2相关的多器官损害和功能障碍包括心肌功能障碍、胃肠道和肝脏疾病以及急性肾损伤（AKI）。自新冠病毒-19大流行开始以来，ACE2-SARS-CoV-2相互作用的研究已在动物模型、人类或灵长类动物的动物细胞（分别包括Caco-2或VeroE6细胞系）和人类永生细胞的使用中进行。由于这些细胞模型存在物种障碍和潜在缺乏特定靶细胞等局限性，类器官迅速开始转化类器官模型来使用，以了解 SARS-CoV-2 感染的第一步，并探索阻断或 扰乱这些进程。类器官模型系统正在成为用于检测和靶向ACE2-SARS-CoV-2相互作用，以及探索阻断或破坏这些过程的治疗性化合物的快速有效工具。尽管如此，类器官仍然不能再现与病毒感染的全身反应相关的全身症状。

肾脏类器官在细胞治疗和组织替代方面的潜力：在未来，基于hiPSC的新疗法有望改善或治愈肾病患者。基于 hiPSC 的肾脏再生的主要方法包括使用基因校正的患者特异性 hiPSC 来解决遗传性肾脏疾病、使用来自健康供体的 hiPSC 来区分肾脏类器官或肾脏细胞进行细胞治疗，以及制造功能性肾脏用于肾移植。然而，迄今为止，这些方法都没有进入临床前或临床试验。很少有研究通过将hPSC肾祖细胞移植到显示肾功能部分恢复的小鼠模型中来测试hPSC衍生的肾祖细胞的治疗潜力。还需要进一步的研究来评估hPSC肾祖细胞的治疗机制（直接或旁分泌）。此外，重要的是要确定 hPSC 肾祖细胞长期扩增的培养条件，同时保持其重建肾单位的能力。此外，在hPSC肾类器官生成期间，缺乏明确定义的NPC群体的鉴定。目前，hPSC 肾脏生成的不同协议依赖于单一的上皮诱导步骤，该步骤不同于天然发育中肾脏的分化过程，其中，如 MacMahon 实验室最近描述的那样，在器官内共存多个分化阶段的肾祖细胞。按照这个逻辑，Oxburgh实验室最近表明，将新分化的细胞与在器官型条件下聚集两天的细胞混合会导致类器官的形成，近曲和远曲小管细胞、连接段或集合管、足细胞和基质细胞数量增加。有趣的是，异混合产生的类器官中的内皮细胞网络比单向分化产生的类器官中的内皮细胞网络更为广泛和复杂。将hPSC NPC和hPSC类肾器官移植到免疫缺陷小鼠的肾包膜下或鸡CAM上产生的hPSC类肾器官具有更好的成熟特性。有趣的是，最近的一项研究使用来自猪肾的去细胞化ECM水凝胶将hPSC类肾脏器官移植到小鼠的肾包膜下，结果表明，类肾脏器官表现出的不良分化少于在没有水凝胶的情况下移植的肾器官。在未来，有必要在移植前开发新的方法来改善肾类器官的成熟和功能。

结论：未来，用于肾细胞治疗的 hiPSC 衍生细胞产品的生产和生物工程肾脏的产生可能为恢复患者肾功能提供有效的治疗方法。尽管如此，这些方法在临床上的适用性仍然很不现实。一些障碍有待解决，包括hiPSC衍生物的免疫能力、hiPSC肾细胞和类器官的可扩展生产，评估其安全性和治疗效果的新方法的开发以及生物工程肾脏移植前成熟的肾脏培养条件的定义等。同时，hPSC 肾脏类器官生成与生物工程技术相结合以设计细胞微环境和模拟生理线索的最新进展为改善肾脏疾病建模和药物毒性评估提供了广阔的前景。

原文出自：Human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids toward clinical implementations - ScienceDirect