摘要：骨肉瘤是影响骨骼的最常见恶性肿瘤。 目前的治疗方法包括手术切除患处和多药化疗，但受转移灶影响的患者的生存率普遍较差。由于骨肉瘤的治疗方法在过去几十年中一直保持不变，因此需要进一步提高对骨肉瘤生物学和治疗学的理解。因此，需要能够准确概括疾病的可靠动物模型。尽管啮齿类动物是骨肉瘤最流行的动物模型，但它们可能无法很好地模拟这种疾病。本综述分析了新兴的非啮齿动物骨肉瘤替代模型，例如鸡绒毛尿囊膜 (CAM) 模型、猪和犬。 这些替代方案中的每一个都比经典的啮齿动物模型具有临床前研究的优势。这些跨物种平台的研究为骨肉瘤的转移生物学和潜在的新疗法提供了见解。

关键词：骨肉瘤  临床前研究  鸡胚尿囊绒毛膜实验  猪  犬 

简介：肉瘤是一组来源于间叶性肿瘤的罕见恶性肿瘤。一般分为软组织肉瘤和原发性骨肉瘤两大类。骨肉瘤是影响骨骼的最常见的恶性肿瘤，尽管被认为是一种罕见的疾病。骨肉瘤以异常类骨生成为特征，可根据受影响的骨细胞（成骨细胞、成软骨细胞和成纤维细胞）进行细分。最常见的是成骨细胞（~60%），成纤维细胞和成软骨细胞的比例相同，尽管治疗与亚型无关。骨肉瘤最常见于长骨和四肢的干骺端生长板，如膝、股骨远端、胫骨近端和肱骨近端。 同样，大约 10% 的骨肉瘤病例会影响中轴骨骼。受影响的肢体因骨和软组织的局部侵犯而丧失功能，最常见于肺转移。骨转移较少，淋巴结转移很少。骨肉瘤主要影响骨骼生长期间的儿童和青少年； 然而，老年人群中出现了第二个发病高峰。目前的治疗方法包括手术切除受影响的骨组织和多药化疗，通常包括多柔比星、顺铂和大剂量甲氨蝶呤。使用这些疗法进行治疗可使局部肿瘤患者的诊断后存活率高达 70%。尽管这种前景看起来很有希望，但转移患者的诊断后生存率要低得多，约为 20%。此外，考虑到大多数骨肉瘤患者的年龄，这些治疗方法与相应的短期和长期副作用有关。骨肉瘤患者面临的其他挑战包括复发（发生在1/3的局限性肿瘤患者）和化疗耐药性的发展，肺转移是骨肉瘤相关死亡率的主要原因。自40年前多药化疗方案问世以来，骨肉瘤患者的死亡率尚未发生显著变化。不幸的是，大多数骨肉瘤病例病因不明，影响骨肉瘤的生物学途径仍不完全清楚。转移研究界认为抑制或延迟转移进展应该是最临床相关的目标，而不是在新疗法出现时减少原发肿瘤。因此，迫切需要个性化的治疗策略和替代的抗转移治疗靶点，以阻止肺转移并可能改善预后。为了进一步推进治疗研究，需要能够准确概括疾病的可靠动物模型。虽然啮齿类动物和兔子仍然是研究骨病最常用的动物模型，但在缺乏啮齿类动物模型的地区，非啮齿类动物模型可能具有优势。转基因小鼠的寿命短、体积小可能会阻碍临床前癌症研究，因为很难评估治疗的长期反应。啮齿动物模型可能既昂贵又耗时，并会引发道德问题。此外，人类和小鼠的癌症生物学不同，包括骨肉瘤转移的位置和肿瘤发生所需的遗传事件。因此，啮齿动物可能无法最好地再现人类骨肉瘤。有益的模型特征包括自发性原发性骨肿瘤和免疫活性宿主内的肺转移，但理想的骨肉瘤动物模型尚未得到一致的鉴定。本文综述了非啮齿类骨肉瘤动物模型的优点和局限性。

CAM模型：鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型已被广泛用作体内系统，用于研究包括骨肉瘤在内的各种癌症的血管生成和转移。CAM 由位于蛋壳正下方的高度血管化膜组成，主要用作生长胚胎的气体交换器官。它可以在壳内（ovo）或无壳模式（ex ovo）进行研究。图1提供卵内CAM分析的概览透视图。肿瘤细胞悬浮液或异种移植的人类肿瘤碎片可以注射到血管中或放置在CAM上。通过这种方式，可以识别供应移植物的血管，并可以研究肿瘤与血管相互作用的形态学方面。由于CAM的表面很容易观察到，因此可以用来研究转移，如肿瘤细胞浸润、血管内内皮细胞相互作用、血管内转运和外渗。CAM远处的肿瘤细胞定植通常使用聚合酶链反应检测肿瘤特异性DNA序列或采集器官进行组织学技术检查。

图 1. CAM 模型概述。

多年来，不同的研究小组已经建立并优化了CAM分析方法来研究骨肉瘤。Balke和同事试图在CAM模型上描述骨肉瘤细胞系形成肿瘤生长的能力。在胚胎发育的第10天，他们将来自8种不同人类骨肉瘤细胞系的300-500万个细胞植入CAM。他们发现其中三种（MNNG-HOS、U2OS和SAOS）在四天后可以形成血管化肿瘤。MNNG-HOS 细胞系显示出最一致和最可靠的生长，因为绒毛膜上皮能够被穿透，并诱导了强烈的血管生成反应。 还注意到人类骨肉瘤生长的其他关键特征，例如坏死和出血。该小组研究的一些局限性在于，并非所有细胞系都能成功形成血管化肿瘤，胚胎死亡率高，18-70%。近十年后，Kunz和他的团队进一步将CAM分析用于骨肉瘤研究。使用一组类似的8种人骨肉瘤细胞系（以及作为参考的细胞系MNNG-HOS），在修改几个参数后，分析CAM中发生的死亡率、肿瘤发生率和骨肉瘤体积。该小组假设，由于外壳的渗透性，消毒剂的使用会影响胚胎的生存能力，研究发现，通过省略过量乙醇的使用，可以将前五天内的死亡率从70%降低到30%。有趣的是，去除乙醇处理没有发现会增加污染率。此外，CAM的预处理在促进肿瘤植入和新生血管形成方面发挥了重要作用。。此外，将肿瘤细胞移植到含有生长因子的基质中可能提高了肿瘤细胞在无血管期的存活率。总之，这些变化导致所有八种人类骨肉瘤细胞系成功生成肿瘤。这些改进进一步巩固了CAM分析作为可靠的异种骨肉瘤移植模型的应用。有几项研究检测了CAM模型中的药物敏感性。使用发现过度表达avβ3整合素的人类骨肉瘤细胞系143B-LM4的转移变体，Tome及其同事试图在CAM分析中研究echistatin（一种去整合素，是已知的avβ3整合素拮抗剂）的疗效。10 日龄的鸡胚的 CAM 接种 143B-LM4 细胞并孵育 7 天以允许肿瘤生长。将肿瘤取出并切成碎片，然后植入另一组10日龄胚胎的CAM中。接下来，CAMs在24小时后接种echistatin或对照PBS。当48小时后进行评估时，发现echistatin可显著减少肿瘤诱导的血管生成。结果提示，αvβ3整合素可能具有作为骨肉瘤药物靶点的临床潜力。然而，该研究没有提到任何限制，给读者留下了许多关于研究设计和适用性的问题。该研究的一些局限性可能包括胚胎的高死亡率，以及第二组10日龄胚胎中不同的肿瘤发生率。

Guder和研究小组的另一项研究调查了CAM模型是否可以使用高级别骨肉瘤的原发肿瘤细胞来测量药物敏感性。经过10天的预孵化期后，他们将来自5名确诊为高级骨肉瘤患者的备用活检组织的原发肿瘤细胞接种到鸡胚的CAM中。在第 16 天， 用阿霉素或培养基处理CAM。 组织学分析显示类骨质形成，治疗组显示出血和部分坏死作为肿瘤消退的指标。有趣的是，Balke 及其同事指出，在他们的模型中没有发生类骨质形成。这可能是因为肿瘤生长的时间跨度很短，只有7天，而Guder团队让CAM与肿瘤细胞一起孵育的时间更长。Kunz 或 Tome 的研究中没有提到类骨质的形成。 Guder 小组的研究局限性包括胚胎死亡率高，导致样本量非常小。Kunz团队的一些优化策略，例如省略消毒剂和CAM的预处理，可以使他们的CAM分析在未来更加成功。总的来说，CAM分析代表了一种可靠的替代性骨肉瘤动物模型。CAM 的短孵育时间和成本效益有利于研究设计。实验也与痛觉无关，因为 CAM 不受神经支配。 因此，不需要道德批准。然而，CAM 模型并非没有局限性。 由于 CAM 模型在发育第 18 天之前是天然免疫缺陷的，因此很难研究肿瘤细胞与免疫系统的相互作用。此外，一些研究指出胚胎的高死亡率。 其他非啮齿动物骨肉瘤模型，如猪和犬，在 CAM 缺乏的地方具有优势。

猪模型：猪代表了研究癌症的一种相对较新的模型。 由于几个世纪以来猪已被驯化为食材来源，与其他物种相比，它们在用于研究时引起的伦理问题较少。它们在生理学、体型和器官大小方面与人类有许多相似之处。此外，与其他研究模型相比，它们的寿命长达 12-15 年，这使得纵向研究能够关注同一动物的疾病进展和消退。因此，猪代表了一种研究转化医学的有前途的新模型。近年来，使用转基因猪来重现人类疾病的情况大大增加。发生骨肉瘤的猪系利用了影响人类 TP53 (p53) 功能的突变的普遍性。 作为人类癌症几乎普遍的特征，p53 的突变会阻碍保护性细胞周期停滞和细胞凋亡。 因此，受损细胞不会被清除，肿瘤发生可以继续进行。TP53 突变在骨肉瘤中特别常见，并且已知发生在大约 50% 的病例中。Leuchs 和团队是第一个在非啮齿类哺乳动物中使用基因靶向通过腺相关病毒和体细胞核转移灭活和突变 TP53。2014 年，Sieren 及其同事生产了内源性 TP53 基因 R167H 纯合和杂合突变的尤卡坦小型猪。他们发现，即使是 30月龄的杂合 TP53R167H 突变猪也没有发生肿瘤。然而，性成熟的纯合子猪出现了多种病变，包括骨源性肿瘤、肾肿瘤和淋巴瘤。在颅骨和长骨中发现了骨源性肿瘤，类似于人类的情况。 总体而言，组织学、影像学和生物学发现与骨肉瘤一致。Tanihara及其同事最近通过电穿孔Cas9基因编辑，制作了另一种猪骨肉瘤模型。这涉及通过引入带有Cas9蛋白的单导向RNA（sgRNA），在体外受精受精卵中靶向 TP53 的外显子 3 和内含子 4。他们培育了9只活仔猪，其中6只携带TP53突变。其中，两只小猪没有野生型序列，四只具有遗传嵌合野生型序列。在监测16个月后，50%的基因编辑猪表现出多种肿瘤表型，例如，没有野生型序列的两只猪表现出下颌骨骨肉瘤（以及肾母细胞瘤），其中一只嵌合猪出现组织细胞瘤。因此，TP53突变猪作为骨肉瘤模型具有非凡的潜力。它们与人类的相似性使得评估新的生物标记物以及成像和治疗方案成为可能。它们为临床医生和外科医生提供了改善癌症治疗学的资源，并且它们与人类药代动力学反应的相似性允许进行更好的药物试验。猪模型可以产生自发骨肉瘤，类似于人类的情况，这一事实也强调了它们作为骨肉瘤模型的有用性。未来的研究可以进一步检查转移和疾病进展，以及骨肉瘤的分子途径。然而，猪模型并非没有其局限性。饲养成本以及时间的要求，都是猪作为模型的弊端。

 犬模型：由于各种原因，犬是人类骨肉瘤的极好模型。与人类一样，骨肉瘤是影响犬骨骼的最常见癌症。临床上，骨肉瘤在犬和人类中的表现相似，因为长骨主要受累。 犬骨肉瘤的转移特征与人类相似，因此继发性肿瘤最常出现在肺部。在临床愈合和技术方面，物种之间的术前、术中和术后程序相似。除了人类之外，犬科动物是唯一一种在完整的免疫系统中发生自发性骨肉瘤的哺乳动物。许多研究评估了犬和人骨肉瘤之间的遗传相似性。如前所述，TP53突变在人类骨肉瘤中很常见。Kirpensteijn和后来Sakthikumar的研究也证实了犬骨肉瘤中的这种联系。Kirpensteijn和他的团队使用聚合酶链反应对客户拥有的宠物进行TP53基因筛查，发现59只患骨肉瘤的犬中有24只具有TP53突变。此外，与TP53表达正常的犬相比，TP53突变的犬在手术后（肿瘤完全切除或边缘切除）的生存时间显著缩短。这项研究没有提到所分析的不同品种，这可能是一个潜在的限制。疾病频率和体细胞突变计数因品种而异，但总体上相似。对于所有三个品种，TP53被发现是点突变水平上最频繁改变的基因。研究人员还发现组蛋白甲基转移酶 SETD2（一种已知的 TP53 调节剂）在来自所有三个品种的犬的 21% 的肿瘤中发生突变。人和犬骨肉瘤之间也存在蛋白质组学相似性。Al Khan及其同事试图通过免疫组化评估骨肉瘤显著标志物在犬组织中的表达，验证犬骨肉瘤作为模型的有效性。波形蛋白、ALP、Runx2 和 BMP-4 等标志物均在肿瘤中高表达，类似于人类骨肉瘤。Roy 和团队的另一项研究调查了人和犬骨肉瘤的转移性和非转移性变异的膜相关蛋白质组学。使用人细胞系 HOS（非转移性）和 143B（转移性）以及犬细胞系 POS（非转移性）和 HMPOS（转移性），分离质膜并进行肽指纹识别。对选定的上调蛋白使用westernblotting、流式细胞术和免疫组织化学进行进一步分析，发现人类和犬中存在类似的受体。此外，他们的结果通过配对的犬骨肉瘤原发和肺转移肿瘤样本进行了验证。促进脉管系统侵袭的蛋白质，如整合素，在两种转移细胞系中均上调。 CD147（一种促进细胞外基质降解的蛋白质）和 CD44（一种与化疗耐药性相关的表面蛋白质）也被上调。与Al Khan及其团队的研究类似，波形蛋白在两种转移细胞系中也被发现上调。这类研究为发现药物靶点提供了基础，并最终改进了治疗方法。总的来说，犬科动物是一种有益的骨肉瘤模型，可以进一步了解疾病生物学并帮助治疗发展。

结论：总之，CAM模型、猪和犬科动物代表了有用的非啮齿类骨肉瘤模型。这些替代动物模型填补了啮齿动物模型存在缺陷的领域的空白。CAM 模型有利于快速评估生成结果，具有成本效益，并且无需道德批准即可开展试验。 猪和犬都是具有免疫活性的模型，可以自发地发展成骨肉瘤，肿瘤的发展和转移类似于人类骨肉瘤。本文一个局限性是没有讨论斑马鱼，它代表了另一种非啮齿动物的骨肉瘤模型，尽管不太常见。这些非啮齿动物模型已经并将继续我们对骨肉瘤遗传学、转移和治疗发现的理解。

原文出自：Non-rodent animal models of osteosarcoma: A review - ScienceDirect