继类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和锌指核酸内切酶（ZFN）之后，出现了新一代的基因编辑工具——CRISPR/Cas9系统。作为能够进行定点基因编辑的工具，CRISPR/Cas9系统迅速成为广大科研工作者的新宠。CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），Cas9的全称是CRISPR-associated protein 9，大家都简称为CRISPR/Cas9系统。Jennifer Doudna等人最初从原核生物中发现一种结构能够抵御外来遗传物质的入侵，张峰最先将这个系统应用于哺乳动物细胞的基因编辑，那么这个CRISPR/Cas9的结构是怎样的？又是如何起作用的？要如何使用它实现基因敲除？ 

CRISPR/Cas9的作用过程主要分为两个阶段，第一阶段，捕获外源引入的序列（对于常用的CRISPR/cas9系统来说，第一阶段是sgRNA和Cas9蛋白结合）；第二阶段，转录之后的crRNA会形成pre-crRNA，引导Cas9蛋白对基因组上与sgRNA相同的靶向区域进行切割，从而达到基因编辑的目的。 

使用CRISPR/cas9实现基因敲除，主要有两种策略。第一种是敲除绝大部分的外显子，将编码靶基因的功能域都敲除。对于这种敲除方式，一般敲除之后就能保证敲除的效果，不会有蛋白残留问题，但是也有一些缺点，如果靶基因过大，敲除的难度会大大增加，另外敲除的片段会游离在细胞中，可能会以NHEJ的形式随机插入到基因组的其他位置，所以会降低敲除的阳性率。 

第二种是敲除个别外显子，造成移码，进而达到敲除的目的。这种敲除方式，在DNA水平，较容易获得纯合敲除的细胞株，但是这种敲除方式，需要在合适的位置设计sgRNA，否则就会出现在DNA水平虽然造成了移码，ORF改变，但是Western Blot（WB）检测可能仍有表达。

图1. 使用CRISPR/Cas9进行基因敲除示意图（来源：赛业生物）。 

另外，也有一些少见的策略，如引入Donor来实现基因敲除。通过引入HR（Homologous recombination）载体，在HR载体中引入终止密码子，使基因翻译终止；或者在HR载体引入筛选标记，将筛选标记插入至目的基因的编码区，破坏目的基因的功能等。 

如上面所讲，鉴定敲除细胞系是否构建成功，需鉴定其DNA水平。片段敲除可有如下的鉴定策略（图2）。设计引物PCR扩增三个区域，分别为两个gRNA作用的区域（Region 1和 Region 2）和敲除区域（Region 3）。如果gRNA作用的区域无法扩增出条带，而完整的敲除区域扩增出比野生型小的条带，则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。

图2. 片段敲除细胞系的鉴定策略（来源：赛业生物）。 

Region 1 （WT:815 bp;  KO:无条带） 

 Region 2 （WT:687 bp;  KO:无条带）  

 Region 3 （WT:2222 bp; KO:~793 bp）

图3. 片段敲除细胞系的电泳鉴定结果。Region 1扩增上游sgRNA切割位点，靶位点被KO之后不能扩增出条带；Region 2扩增下游sgRNA切割位点，靶位点被KO之后不能扩增出条带；Region 3扩增包含整个KO的区域，KO后的条带小于WT的条带（来源：赛业生物）。 

sgRNA敲除通常会产生数量较少的碱基插入或缺失（indel），当产生的indel数量不是3的倍数时则造成移码，进而达到敲除的目的。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，所以无法鉴定是否产生indel。需要继续对扩增的产物进行测序鉴定。将测序结果与野生型序列进行比对，如果发生非3倍数的indel，则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。 

图4. 移码敲除细胞系的鉴定策略与结果，与原始序列相比，插入了两个碱基，造成移码（来源：赛业生物）。 

移码突变除了鉴定DNA水平，还可以通过WB检测确认敲除的效果。如图5所示，在敲除细胞系中无目的蛋白的表达，说明该敲除细胞系构建成功。根据赛业众多案例的成功经验，在方案设计阶段综合考虑多种因素，科学设计sgRNA，无论是移码敲除还是片段敲除均能获得理想的实验结果。

图5. Western Blot检测蛋白敲除效果检测（来源：赛业生物）。

开展敲除实验时，目的基因、细胞类型、下游实验等均会影响方案设计和最终的敲除结果。所以需要根据实际情况来设计方案。比如需要考虑目的基因是否会影响细胞存活、细胞类型对敲除效率的影响和导入方法对下游实验的影响等。如果敲除与细胞周期、增殖、代谢等相关的基因，会存在敲除致死的情况，难以获得敲除纯合细胞株；对于增殖速度慢的细胞类型，往往难以开展敲除实验，这是由于细胞增殖过慢影响细胞的DNA修复活性并降低了编辑效率。 

另外将CRISPR/Cas9体系导入细胞的方式也是多种多样的，我们常用的有三种，蛋白法、质粒法、病毒法。一般我们会选用蛋白法来做，直接合成sgRNA单链，和Cas9蛋白在体外孵育形成RNP复合物，在通过电转的形式将RNP复合物导入细胞中，这样既在较短时间内获得纯合敲除的单克隆细胞株，又不会在基因组上造成外源基因的整合，省时高效。质粒法和病毒法适合用于细胞倍增较慢的细胞系，相较于蛋白法来说，病毒法会引入外源质粒序列的整合，具体如何选用敲除方式，还要根据下游的实验来综合判断。