背景：

目前在全球范围内因为眼部疾病致盲人数约有4000万，这其中有相当一部分属于遗传性视神经病变，如老年黄斑变性、Leber先天性黑朦、Leber遗传视神经病变等等^[1]。

随着基因疗法的兴起，通过腺相关病毒(AAV)、慢病毒(LV)等作为药物递送载体，对遗传性眼部疾病进行基因修正已经取得许多重大进展，越来越多的基因药物被开发出来，而小鼠作为常用的药物筛选模型，在基因治疗的临床前研究中占据重要地位。

眼球作为相对独立的器官，球内注射是最有效的药物递送方式。眼球注射可突破血眼屏障,使药物迅速浓集于眼内, 继而在眼内扩散到达作用部位。具有代表性的眼内注射给药途径有视网膜下(subretinal)注射和玻璃体腔(Intravitreal)注射，玻璃体内注射能够使基因药物可以较快扩散至视网膜或脉络膜部位，如临床上常用于老年性黄斑变性的药物输送；视网膜下注射可将药物直接传递到视网膜和视网膜色素上皮细胞(RPE)之间的潜在空间，是将药物直接递送至RPE细胞的最佳方法。

玻璃体注射和视网膜下注射示意图^[2]

一、视网膜下注射

实验仪器耗材：

手术器械、吸入式麻醉机、Hamilton注射器（30G、33G）、托品酰胺、去氧肾上腺素、手术显微镜

实验步骤：

1. 动物麻醉

1) 小鼠置于诱导盒内进行吸入式异氟烷麻醉，捏合小鼠脚指确认是否麻醉完全

2) 将老鼠转移到解剖显微镜下，连接鼻锥持续给予异氟烷

3) 待注射眼睛滴加一滴丙美卡因(或类似的表面麻醉剂)防止注射引起局部反射，轻触结膜确定麻醉深度。

2. 扩瞳

1) 倾斜鼠标头部，使待注射眼睛在视野范围内，用棉签擦去任何多余的液体

2) 向待注射眼球滴加1-2滴1%托品酰胺和0.5%去氧肾上腺素用于扩大瞳孔

3. 巩膜切口

1) 使用镊子在上下眼睑之间滑动，使眼球从眼窝中伸出，暴露巩膜

2) 采用30G针头在角巩膜缘后面做一个小的巩膜预切口，如果液体从切口处流出，则针头穿刺过深而进入玻璃体腔，之后注射过程中的液体可能进入玻璃体腔

角巩膜缘稍后处切口示意图

4. 注射

1) 用镊子轻轻捏紧缘下约1mm处的结膜保持眼球固定

2) 将装好注射液的33G注射针插入预切口，针与眼球表面相切，沿巩膜内表面穿过，尖端进入约1mm，穿过巩膜和脉络膜，到达视网膜下间隙

3) 操作注射器平稳注入适量液体，注意注射过程避免晃动引起额外的组织损伤

4) 注射后，停留针头约30秒，以防漏液，然后将针头慢慢抽出

5) 取出镊子，重新放置结膜，轻轻将眼睛放回眼窝，闭上眼睑

6) 如果需要双侧眼球注射，将另一面眼球转到显微镜视野下重复上述步骤

视网膜下注射进针示意图^[3]

R480玻璃电极注射泵搭配显微操纵器可满足大小鼠眼球精准注射实验，采用更细的玻璃毛细管代替常规33g注射针头保证更小的注射损伤

5. 恢复

1) 可在角膜和注射区域涂抹抗生素眼药膏防止感染

2) 将动物放在加热垫上使其完全恢复(2-3分钟)，然后将其转移回笼子继续饲养

二、玻璃体内注射

玻璃体内注射与视网膜下注射类似，在用镊子保持眼球稳定的同时，将装好药物的针头，相对视神经约60度角，从角巩膜缘(Limbus)后预切口，插入约1mm进行玻璃体腔注射。需要注意晶状体占据玻璃体腔的大部分，应小心避免刺穿晶状体。

玻璃体腔注射进针示意图^[4]

注意事项：

1）眼球注射过程应确保动物眼睛一直湿润，避免角膜干燥，可根据需要多次使用润滑滴眼液。

2）注射过程应缓慢进行，避免速度过快造成液体从注射部位回流

3）眼球注射前应充分扩瞳，瞳孔过小不易看清眼底，会降低注射成功率，同时瞳孔过小也是虹膜出血的主要原因

4）角膜穿刺点靠近角巩缘处为好，以免形成角膜白斑而影响后续动物实验

5）视网膜下注射，注射针插入切口部位，应平行于眼外壁推进，保证准确进入视网膜下空间，如果太靠近外壁或太深，将会导致注射针进入错误位置。

【参考文献】

1.Bourne R, et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment:a syste-matic review and meta-analysis.Lancet Glob Health.2017;5:e888–e897

2.Katherine JW,et al.Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.J Vis Exp.2012;(69):4286

3.Bennett J,et al.Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after rAAV-mediated retinal transduction.Methods Enzymol.2000;316:777–789.

4.Cameron EG,et al.Optic Nerve Crush in Mice to Study Retinal Ganglion Cell Survival and Regeneration. Bio Protoc.2020;10(6):e3559