摘要：解草嗪（BN）是一种高效的二氯乙酰胺除草剂解毒剂，通常用于保护作物免受除草剂的损害。作为一种常用的农用化学品，这种除草剂解毒剂持续排放在河道中，从而对水生生物造成毒性，并最终导致食物链污染。迄今为止，尚未评估其对水生生物心脏发育的潜在毒性。在本研究中，我们选择斑马鱼作为模型来研究 BN 对胚胎发育和心脏毒性的影响。斑马鱼胚胎在受精后5.5至72小时（hpf）暴露于0.5、1.0和2.0 mg/L BN中。结果表明，暴露于BN导致死亡率增加，心脏缩小和胚胎孵化率降低。BN暴露还引起心包水肿（PE）和心脏线性拉伸。此外，暴露于BN会导致斑马鱼胚胎中活性氧（ROS）的过度积累以及过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）等抗氧化酶的异常活性。此外，暴露于 BN 会导致胚胎严重的心脏毒性，伴随着心脏发育和细胞凋亡相关基因的异常。令人惊讶的是，虾青素（ASTA）作为一种常见的抗氧化剂，被发现能够部分挽救 BN 引起的心脏毒性，这表明 ROS 可能是导致斑马鱼胚胎心脏毒性的主要原因。我们的研究结果表明需要对定期暴露BN进行全面的安全评估，这为制定健康标准和评估水生生物甚至人类的潜在风险提供科学依据。

关键词：解草嗪  斑马鱼 氧化应激 心脏毒性 

简介：除草剂通常用于保护作物免受杂草的有害影响。 由于作物产量的增加，据估计美国一年消耗除草剂3.08亿公斤，约占全球除草剂用量的21%。在作物系统中大量使用除草剂通常会释放大量有毒物质，导致土壤和水污染。此外，大多数除草剂不仅能杀死杂草，还能破坏作物，并且对非目标生物具有毒性。这就要求使用另一种叫做除草剂安全剂的化合物来抵消除草剂本身的这些有害特性。除草剂安全剂被归类为生物活性“惰性”成分，商业上用于削弱或消除除草剂对作物的毒性。根据市场调查，2011年，约30%的除草剂与安全剂合用。值得注意的是，除草剂安全剂具有相反的特性：它们增加作物对除草剂的耐受性，但也对环境产生负面影响。然而，除草剂安全剂（包括BN）的大量使用可能导致环境污染和水生动物的毒性。辛醇-水分配系数（Kow）是评价有机污染物在环境中迁移转化的重要指标。相关研究表明，BN的Log Kow估计约为3，BN的好氧/厌氧土壤半衰期（DT50）为5至49天。BN 较低的 Log Kow 和 DT50 表明其进入地表水和渗入地下水的潜力。因此，鉴于除草剂安全剂在农业上的广泛使用和在环境中的生物积累，评估其对非靶器官和生物体的毒性，从而研究其对水生野生动物甚至人类的影响是必不可少的。然而，很少有研究详细阐述非目标生物暴露于BN作用下的情况。已知三种可购买的安全剂（AD-67、FM和FZ）对斑马鱼胚胎的毒性，结果表明在浓度远低于96 h-LC50的情况下，胚胎暴露于AD和FM会增加24 h的孵化率，而在96 h时会降低孵化率。发现这三种安全剂会引起氧化应激、降低 SOD 的活性并诱导异常的谷胱甘肽还原酶 (GSH)活性。这些结果表明，暴露于AD、FM和FZ后，斑马鱼胚胎中可能产生发育毒性，因此必须高度警惕除草剂安全剂的毒性，并开发新的替代安全剂的替代溶液。斑马鱼是环境毒理学研究中一种合适的模式生物，可用于高通量筛选有害化合物，尤其是特定器官毒性（如肝脏、肾脏和心脏）。本研究以斑马鱼为研究对象，评估BN暴露引起的形态异常，检测氧化应激、凋亡相关基因表达、心脏发育等指标，揭示BN对斑马鱼早期心脏和胚胎发育的毒性 ，并披露 BN 对水生生物甚至人类的潜在毒性。

结果：BN对斑马鱼胚胎的发育毒性：为了揭示其发育毒性，用不同浓度的BN（0.5、1.0和2.0 mg/L）孵育5.5 hpf的斑马鱼胚胎。计算5.5,24,48,72hpf胚胎总死亡率。在 48 和 72 hpf 时计算心率和孵化率。如图1A所示，BN处理的胚胎的总死亡率以浓度依赖性方式增加，而在正常情况下20 s内的心跳频率降低。随着BN浓度的增加，48 hpf和72 hpf的胚胎孵化率显著下降。这些结果表明，暴露于BN的斑马鱼胚胎以浓度依赖性方式引起胚胎发育毒性。

图1、解草嗪可对斑马鱼胚胎造成发育毒性。

BN对斑马鱼胚胎的心脏毒性：为了研究BN对斑马鱼胚胎发育的毒性，选择Tg（myl7:GFP）斑马鱼转基因系观察心脏的形态学变化。BN增加了斑马鱼胚胎的心包水肿（PE），导致心脏线性拉伸。同时对照组和不同浓度BN组处理的心脏之间的比较表明，暴露于BN的胚胎的心脏未能进行环化。HE染色的组织学分析结果表明，BN暴露的胚胎导致了 心肌层异常，心房和心室呈线性趋势。

图 2、 72hpf 对照组和 BN 处理组中斑马鱼胚胎的表型特征。

图3、对照组和不同浓度BN处理组胚胎HE染色的组织学分析。

氧化应激分析：过量的活性氧会对细胞内的生长因子、蛋白质、核酸和碳水化合物造成有害损害，最终导致细胞凋亡。SOD和CAT作为抗氧化酶，通常被转运以清除内源性和过量的ROS。随着斑马鱼胚胎暴露于增加的BN浓度，ROS的产生显着增加，导致SOD和CAT活性升高。丙二醛（MDA）活性表现出先降低后明显升高的趋势。暴露于BN后，在心血管部位观察到大量ROS积累。

图4、解草嗪诱导斑马鱼幼虫氧化应激。

凋亡相关基因的表达：随着试验浓度的增加，对暴露于BN的72 hpf斑马鱼胚胎细胞凋亡相关基因的表达进行了分析。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，编码caspase 3的促凋亡基因的转录水平随着BN浓度的增加而上调。进一步检测到caspase 9基因轻微减少。这些结果表明BN诱导斑马鱼胚胎凋亡。

图5、解草嗪在 BN 处理的斑马鱼胚胎中诱导细胞凋亡相关基因。

斑马鱼心脏发育相关基因的表达变化：为了研究BN对胚胎心脏发育的影响，我们分析了斑马鱼胚胎心脏相关基因表达的变化。分析nkx2.5、myh6、tbx5a、vmhc和nppa的表达，结果显示BN处理组表达上调，而gata4和tbx2b的表达降低。因此，在基因水平上，暴露于BN会导致斑马鱼胚胎的心脏畸形。

图6、解草嗪诱导斑马鱼胚胎心脏发育基因的异常表达。

ASTA部分挽救了斑马鱼胚胎，使其免受解草嗪诱导的毒性。虾青素（ASTA）是一种常见的抗氧化剂，具有清除内源性活性氧的能力。为了研究 BN 引起的氧化应激是否是 BN 暴露导致心脏毒性的主要原因，斑马鱼胚胎与 ASTA 和 1.0 mg/L BN 共同孵育。表型图像显示，经 BN 处理的胚胎心脏的形态学损伤通过 ASTA 处理部分恢复。

图 7、ASTA 部分挽救了 BN 引起的心脏形态学损伤。同时，ROS染色结果表明，与BN处理组相比，ASTA处理组（1.0 mg/L BN+ASTA）ROS荧光减弱，心包心脏水肿（PE）得到挽救。因此，ASTA治疗部分挽救了BN诱发的心脏毒性。

结论：研究结果表明斑马鱼胚胎暴露于解草嗪 会引起严重的心脏毒性并改变与心脏发育相关的基因的表达。同时，在胚胎心脏组织中检测到氧化应激升高和细胞凋亡。我们已经证实，检测到的 BN 引起的心脏毒性可以被一种名为虾青素的抗氧化剂部分挽救，表明这种除草剂安全剂导致的氧化应激是斑马鱼胚胎心脏毒性的主要原因。综上所述，我们的研究结果为更好地了解除草剂安全剂在环境中的毒性以及全面探索对人类健康的潜在危害提供了新的视角。

原文出自：Benoxacor caused developmental and cardiac toxicity in zebrafish larvae - ScienceDirect