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动物实验

DVC系统科研应用系列：小鼠实验揭示昼夜节律

2021年12月15日来源：泰尼百斯作者：责任编辑：lascn

摘要：今天我们给大家分享一篇发表于今年Scientific Reports的论文：稳定环境下饲养的C57BL/6小鼠的自主活动量存在大幅波动（Major oscillations in spontaneous home‑cage activity in C57BL/6 mice housed under constant conditions）。该研究指出正常小鼠的活动本身是存在类季节性波动的，这个新发现的小鼠节律现象可能影响到所有小鼠实验的结果。

生命是有节律的，不只人的生命有节律，实验小鼠也是如此。一般来说，小鼠白天睡觉，晚上摄食、活动、交配和探索。小鼠的某些行为，比如跑轮和摄食，是药物疗效、药物毒性、和一些精神疾病研究中常用表征。但是小鼠的节律很可能大幅影响小鼠的行为，继而影响到使用小鼠做模式动物的行为学研究的结果。考虑到小鼠在生命科学领域中的重要地位，更应该加强小鼠正常行为和节律性的研究。

今天我们给大家分享一篇发表于今年Scientific Reports的论文：稳定环境下饲养的C57BL/6小鼠的自主活动量存在大幅波动（Major oscillations in spontaneous home‑cage activity in C57BL/6 mice housed under constant conditions）。该研究指出正常小鼠的活动本身是存在类季节性波动的，这个新发现的小鼠节律现象可能影响到所有小鼠实验的结果。

研究亮点

为期19个月、针对64只C57BL/6小鼠的长期研究显示：

· 小鼠夜间活动量高于白天，外界因素，如光照和换笼操作，会影响小鼠的活动量和节律性；

· 小鼠的活动量存在周期性波动，平均周期为97天，这一波动与季节无关；

· 雌性鼠的平均活动量高于雄性鼠，且夜间活动比例更高；

· 小鼠的活动量与摄食量呈正相关，与体重均呈负相关。

生物的行为有很强的节律性，目前研究最多的是昼夜节律。昼夜节律受到下丘脑信号的调节，靶点在体细胞内广泛表达。简单来说，下丘脑视交叉上核神经元内表达的关键时钟基因与地球的太阳日（24h）之间存在反馈调节环路，生物的昼夜节律（21h到27h）就来源于这一环路。哺乳动物的视神经元可以直接感受到光刺激，或者非直接地经过视锥细胞和视杆细胞，将信号传递到多个脑部区域，其中最重要的是视交叉上核，然后再传递到上丘脑。位于松果体的细胞接受并转化这一信息，继而抑制五羟色胺转化为褪黑素的化学反应。

实验用小鼠一般为近交品系，生活在严格控制的稳定环境下，环境温度、湿度和光照时间不随季节和年份变化。一般情况下，小鼠实验的设计会考虑到品系、年龄、性别和昼夜节律，但是季节性节律不在考虑范围内。

本研究使用泰尼百斯的DVC系统，进行了非侵入、自动化、24小时不间断的小鼠笼内活动量分析，实验时间长达19个月，具体原理参见实验方法部分。

本研究包含14笼雄性（n = 52，11笼）和雌性（n = 12，3笼）C57BL/6小鼠，实验开始于鼠龄7到12周，直到鼠龄~16个月（n = 11）和鼠龄~700天（n = 3），这一长期观察和分析显示出小鼠在饲养笼内正常活动量的变化情况和波动规律。

实验方法

实验分组

Table. 1 本研究中使用的动物详情、实验分组、DVC数据采集和动物饲养条件[1]

DVC数据采集

DVC系统（参见下图，[1]）的核心是放置在标准IVC笼盒下方的一块电子传感器集成阵列。这块传感器由12个平面传感电极组成，呈阵列排布，其功能基于电容。一个距离传感器每秒钟检测4次这12个电极的电容，即每250毫秒检测一次。电容值受到电极附近物体的介电性质的影响，如果有动物在电极上方的笼内活动，电容值就会发生改变。因此，动物在电极阵列平面的运动会被检测到，并记录为电容值的变化。通过定制算法的应用，研究人员收集了动物在饲养笼内的活动量。在这个研究中，研究人员使用了原始信号的一阶差分作为动物活动量的度量标准。将每块电极两次测量之间（间隔250毫秒）的绝对差值，与一个预设的阈值（电容背景值）进行比较，来定义一次活动事件。因此，这个度量标准将任何导致电容值显著改变的动物活动归为一次活动事件（一次激活）。本研究中，研究人员使用了12个电极、每分钟的平均激活次数，也就是12个电极、240个时间点的平均激活次数。关于电极阵列的空间分辨率，请见[2, 3]。注：该活动量度量标准代表的是笼内所有动物、笼内所有电极产生的笼内总体活动量，而不是群体饲养的动物的个体活动量。然而，已有其他研究显示，本研究使用的度量标准所得出的活动量和动物的笼内活动水平耦合度很高[3]。DVC只记录动物在笼盒底部的活动。

数据处理和统计学方法

本研究的数据处理工具是R语言（版本3.5.0），涉及的分析方法包括：频谱分析，函数型数据分析，线性回归，纵向数据的统计学分析。所有脚本均为开源、R语言脚本。详细分析方法请参见[1]。

主要结论

1. Fig. 1展现了DVC记录到的组1 - A04笼小鼠的活动情况。从热点图Fig. 1a和曲线图Fig. 1ba至Fig. 1bc可以看出：小鼠在关灯时间段的活动量整体上高于开灯时间段的活动量，并且活动量的变化大致遵循以24h为单位的循环，这些现象再次验证了小鼠的夜行习性和昼夜节律；开灯前后小鼠的活动量均较高，但是只有关灯后活动量较高，关灯前活动量仍保持在较低水平；换笼的那一天，小鼠在开灯时间段的活动量激增，这一现象代表了外界因素对小鼠昼夜节律的影响。热点图Fig. 1c显示出小鼠434天的活动量，长期活动量的变化符合上述趋势。

Fig. 1

2. 从Fig. 1c和Fig. 2、Fig. 4a–c可以得出，小鼠活动量的整体变化趋势是下降的，也就是说随着小鼠鼠龄的增加，它们的活动量是减少的；从鼠龄70天到470天，小鼠运动量的减少幅度分别是：18%（组3）、22%（组1）和28%（组2）；并且，虽然所有笼的小鼠的健康状况均为良好，但是这一年龄相关的活动量的减少，在笼与笼之间存在很大的差异（范围为<-1%到-43%）。

3. Fig. 2展现了组1全部8笼的活动量，显示小鼠活动量从最高点到最低点波动的现象每笼都有，平均来看，最高点与最低点的差异是平均活动量标准差的1.6倍，波动与波动之间的差异是标准差的±0.61倍。

Fig. 2

4. 在组1全部8笼的活动量数据的基础上，以每笼每分钟为计算单位，进行活动量频谱分析，观察到活动量存在周期各异的集群现象，并将结果制成了数据周期图Fig. 3。从图上可以看出，与关灯/开灯相关的活动量峰值出现的频度很高，分别在一周的第12h、24h和168h（换笼时间），这一现象与上述相符，是在预期之内的。除此之外，还观察到未知来源的低振幅、高频度的峰值和高振幅、长波长的集群。与外部因素相关的峰值，在笼与笼之间同步出现；但是低频度、高振幅的峰值集群，在笼与笼之间并不存在同步现象。

Fig. 3

5. Fig. 4a和Fig. 4b呈现的是组1每笼小鼠的日均活动量变化趋势，低频度的最高值与最低值出现的日期可以从中提取出。从Fig. 4d可以得到，低频度波动的时间跨度是2到4个月，波动时间跨度的平均值是97天。但是，这些缓慢的活动量波动在笼与笼之间不存在同步现象，并且这些波动与季节变动也不同步。

Fig. 4

6. 从Fig. 5可以看出：最高值出现时的周平均活动量比最低值出现时的周平均活动量高63%；最高值出现的一周内，与关灯相关的最高活动量，比最低值出现的一周内高64%；最高值出现的一周内，与开灯相关的最高活动量，比最低值出现的一周内高59%；并且，雌性鼠在笼内活动量高于雄性，符合先前研究得到的结论[2]；

Fig. 5

7. 在恒定环境下人工饲养的C57BL/6小鼠是夜行性的，白天多用来休息，所以本研究接下来分析了小鼠夜间活动比例上的变化。从Fig. 6可以看出，最高值出现的时候，夜间活动量占全天总活动量的比例，与最低值出现的时候相比，是不存在差异的，所以这些缓慢的活动量波动没有改变小鼠的昼夜习性。除此之外，雌性小鼠的夜间活动比例高于雄性小鼠。